青藤碱对人外周血CD4T细胞CD69分子表达及细胞凋亡影响的体外研究

摘要

目的：通过对人外周血CD4+T淋巴细胞增殖模型实验，检测盐酸青藤碱Alkaloidsinomenine(SIN)对人外周血CD4+T淋巴细胞CD69分子表达和细胞凋亡的影响，研究SIN对人外周血CD4+T淋巴细胞免疫抑制作用及效应，进一步探讨SIN对人T淋巴细胞免疫抑制作用的分子生物学机制，为临床应用SIN进行器官移植免疫治疗的提供理论依据。 方法：从衡阳市中心血站采集一个健康人外周静脉血50ml，肝素(10U/ml)抗凝血。用淋巴细胞分离液从血标本中分离单个核细胞(PBMC)，制成PBMC悬液。采用免疫磁珠阳性分离法从PBMC悬液中将CD4+T淋巴细胞分离。将分离所得CD4+T淋巴细胞用RPMI-1640/10％FCS完全培养液在37℃，5％CO2条件下培养。CD4+T淋巴细胞经植物血凝素(PHA，终浓度为10ug/ml)和白介素-2(IL-2，终浓度为0.01ug/ml或100U/ml)扩增7天后，均分为5组细胞(各组细胞为5×105个/ml，10ml)，加以处理因素后分别培养：1)对照组：细胞培养液中不加入任何药物；2)genistein组：细胞培养液中加入终浓度为50umol/L的genistein溶液，；3)低浓度SIN组：细胞培养液中加入终浓度为10umol/L的SIN溶液；4)中浓度SIN组：细胞培养液中加入终浓度为200umol/L的SIN溶液；5)高浓度SIN组：细胞培养液中加入终浓度为1000umol/L的SIN溶液。各组细胞分别在1个培养瓶中培养，细胞浓度为3-5×105个/ml，细胞悬液体积为9-10ml。6小时后，各组细胞培养液中加入终浓度1ug/ml的抗CD3单克隆抗体，每组分为3试管，继续培养24小时后，然后用流式细胞仪(FCM)检测CD69分子的表达率和细胞凋亡率。　　结果：FCM检测CD4+T淋巴细胞CD69分子表达结果(％)：1)对照组：87.42±0.96；2)genistein组：36.53±1.17；3)低浓度SIN组：85.46±1.52；4)中浓度SIN组：62.45±1.09；5)高浓度SIN组：43.70±0.62从结果可以看出：。低浓度SIN组的细胞与空白对照组的CD69分子表达水平最高；低浓度SIN组、中浓度SIN组、高浓度SIN组、genistein组的CD69分子表达水平依次降低，genistein组的CD69分子表达水平最低；除低浓度SIN组的CD69分子表达水平与空白对照组无显著差异外(P＞0.05)，其它各组组间CD69分子表达率均数两两比较均有显著性差异(p＜0.05)。　　FCM检测CD4+T淋巴细胞亚二倍体表达率(％)：对照组：1.70±0.30；genistein组：21.17±1.21；低浓度SIN组：1.83±0.15；4)中浓度SIN组：6.90±0.30；5)高浓度SIN组：10.17±0.32。从结果可以看出：低浓度SIN组的CD4+T淋巴细胞亚二倍体表达率与对照组的亚二倍体表达率最低；低浓度SIN组、中浓度SIN组、高浓度SIN组、genistein组CD4+T淋巴细胞亚二倍体表达率依次增高,genistein组的CD4+T淋巴细胞亚二倍体表达率最高；除低浓度SIN组的CD4+T淋巴细胞亚二倍体表达率与对照组无显著差异外(p＞0.05)，其它各组组间亚二倍体表达率均数两两比较均有显著性差异(p＜0.05)。　　结语：SIN对人外周血CD4+T淋巴细胞增殖模型具有一定抑制作用，它可能通过诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡，抑制CD4+T淋巴细胞CD69分子表达而产生免疫抑制作用，且这种作用呈浓度依赖关系。SIN可能成为一种具有开发前景的免疫抑制药物。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

主要缩略语中英文索引

摘要

第一章前言

第二章材料与方法

第三章结果

第四章讨论

第五章结语

参考文献

CD69分子研究进展

读研期间发表的论文

致谢