青藤碱对人外周血CD4+T细胞凋亡和P-ERK1/2及IL-2表达影响的体外研究

摘要

目的:研究青藤碱(Alkaloid sinomenine,SIN)对人外周血CD4+T细胞凋亡和P-ERK1/2及IL-2表达的体外影响,探讨SIN对人外周血CD4+T细胞免疫抑制作用的效应和分子生物学机制,为临床应用SIN进行器官移植免疫治疗的提供理论依据。
　　方法:在衡阳市中心血站抽取三个健康人肘静脉血50ml,肝素(10U/ml)抗凝。用淋巴细胞分离液从血液标本中分离PBMC,并制成PBMC悬液。通过免疫磁珠分离法从PBMC悬液中分选CD4+T细胞。将CD4+T细胞用10％FCS RPMI-1640完全培养液在37℃、5%CO2条件下培养。CD4+T细胞经终浓度为5ug/ml的PHA和终浓度为100U/ml的IL-2扩增7天后,将扩增后的的细胞用PBS洗3遍,各组细胞培养液中加入终浓度为1ug/ml的抗CD3单克隆抗体,继续培养6小时后,各均分为6组细胞培养并作以下处理:(1)、I组(空白对照组):细胞培养液中不加入任何药物;(2)、II组(CsA组):细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的CsA溶液;(3)、III组(低浓度 SIN组):细胞培养液中加入终浓度为10umol/L的SIN溶液;(4)、IV组(中浓度SIN组):细胞培养液中加入终浓度为200umol/L的SIN溶液;(5)、V组(高浓度SIN组):细胞培养液中加入终浓度为1000umol/L的SIN溶液;(6)、VI组(CsA+中浓度SIN组):细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的CsA溶液和终浓度为200umol/L的SIN溶液。继续培养24小时后,对各份细胞进行检测:1)、流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率;2)、Western blot法检测P-ERK1/2蛋白表达;3) ELLSA法检测IL—2表达。
　　结果:1、FCM检测CD4+T淋巴细胞亚二倍体表达率(%):1)对照组:1.70±0.30;2) CsA组:1.70±0.15;3)低浓度SIN组:1.83±0.15;4)中浓度SIN组:6.9±0.30;5)高浓度SIN组:10.17±0.32;(6)CsA+中浓度SIN组:6.67±0.40。从结果可以看出:低浓度SIN组、中浓度SIN组、高浓度SIN组CD4+T淋巴细胞亚二倍体表达率依次增高,中浓度组、高浓度SIN组及CsA+中浓度SIN组与对照组及低浓度SIN组、CsA组存在显著性差异(p<0.05)。2、Western blot法检测P-ERK1/2蛋白的表达水平(灰度值):1)对照组:3.15±0.06;2) CsA组3.15±0.05;3)低浓度SIN组:3.09±0.04;4)中浓度SIN组:0.93±0.03;5)高浓度SIN组:0.64±0.03;6)CsA+中浓度SIN组0.93±0.02。从结果可以看出:低浓度SIN组、中浓度SIN组、高浓度SIN组CD4+T淋巴细胞亚二倍体表达率依次降低,中浓度组、高浓度SIN组及CsA+中浓度SIN组与对照组及低浓度SIN组、CsA组存在显著性差异(p<0.05)。3、ELLSA法检测IL—2表达水平:1)对照组:10.17±0.42;2) CsA组:5.26±0.39;3)低浓度SIN组:10.30±0.46;4)中浓度SIN组:8.9±0.20;5)高浓度SIN组:6.47±0.31;6)CsA+中浓度SIN组4.37±0.38。从结果可以看出:低浓度SIN组与对照组无显著差异外(p>0.05),其它各组组间IL-2表达水平均数两两比较均有显著性差异(p<0.05)4、结果提示:1)SIN能诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡,作用与浓度正相关(r=0.892)。2)SIN诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡的过程中, P-ERK1/2信号被迅速抑制其作用与浓度相关(r=0.933).3)SIN能降低IL-2的表达,作用与浓度相关(r=-0.949)且与CsA联用有明显协同作用。4)SIN与CsA联用在诱导细胞凋亡抑制P-ERK表达无明显交互作用5)经不同浓度的SIN处理后,人外周血CD4+T细胞凋亡率和P-ERK1/2的表达水平存在负相关(r=-0.833)
　　结语:SIN能抑制IL-2的合成,且在诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡的过程中, P-ERK1/2信号被迅速抑制,这种作用呈浓度依赖关系。SIN对人外周血CD4+T细胞免疫抑制作用的分子生物学机制可能与其抑制P-ERK1/2蛋白信号及IL-2相关。它有望成为一种具有开发前景、免疫抑制效果确定的新型免疫抑制剂。

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中文摘要

英文摘要

第一章 前 言

第二章 材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

三，统计分析方法

第三章 实验结果

一、流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率(%)检测结果

二、Western blot法检测P-ERK1/2蛋白表达水平结果

第四章 讨 论

一、人外周血CD4+T淋巴细胞增殖模型的建立

二、SIN的作用及其作用机制探讨

三、展 望

第五章 结 语

参考文献

细胞凋亡与器官移植

读 研 期 间 发 表 的 论 文

致谢