迷迭香酸拮抗HO诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡及作用机制

摘要

目的：研究迷迭香酸对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞株ECV304凋亡的抑制作用及其机制。　　方法：采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304，首先用H2O2孵育细胞24小时，用流式细胞术鉴定内皮细胞凋亡率；用吖啶橙荧光染色(AO染色)观察细胞凋亡形态，确定H2O2诱导内皮细胞凋亡的最佳浓度。然后按如下分组并处理：(1)正常对照组；(2)H2O2损伤组；(3)迷迭香酸(0.3、1、3、10μmol/L)+H2O2组；(4)维生素E+H2O2组。在迷迭香酸和维生素E预处理该细胞30分钟后，加入H2O2继续培养24小时，应用MTT比色法检测迷迭香酸对细胞活性的影响；流式细胞仪检测法和Tunel法检测迷迭香酸对细胞凋亡率的影响；用Western-blotting检测不同分组处理24小时细胞中凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白的表达情况和第24小时caspase-3活性。　　结果：内皮细胞用H2O2孵育24小时，低浓度的H2O2(0.1mmol/L，0.2mmol/L)凋亡不明显，0.5mmol/LH2O2时细胞凋亡明显，细胞荧光染色出现核浓缩、碎裂等凋亡特征，细胞凋亡率达24.4％；同时伴有Bcl-2蛋白表达减弱，Bax蛋白表达增加，caspase-3蛋白活性增强。而用不同浓度迷迭香酸预先保护可见：(1)MTT法检测H2O2孵育内皮细胞24h，细胞活性由正常时1.00±0.02下降到0.69±0.02。不同浓度的迷迭香酸与H2O2共同孵育内皮细胞，呈浓度依赖性的增加内皮细胞活性，0.3、1、3、10μmol/L迷迭香酸使细胞活性分别恢复到0.71±0.07、0.78±0.05、0.84±0.03、0.89±0.03，与H2O2组相比，1、3、10μmol/L迷迭香酸预处理组数据有显著差异(P＜0.05)；(2)流式细胞仪结果显示：0.5mmol/LH2O2明显诱导细胞凋亡，凋亡率为23.53±3.77％，不同浓度的迷迭香酸使细胞凋亡率呈浓度依赖性下调(20.01±0.70％、12.47±1.36％、10.4±0.40％、6.57±4.24％，p＜0.05)；(3)TUNEL法染色细胞镜下观察，棕褐色深染的阳性细胞明显减少，镜下凋亡细胞计数与流式细胞计数一致：H2O20.5mmol/L作用24h后部分细胞核呈棕褐色，凋亡细胞计数25.5±2.12％，迷迭香酸0.3、1、3、10μmol/L降低细胞凋亡，凋亡率分别为21.3±2.15％、17.5±1.23％、14.5±1.23％、10.5±1.51％，P＜0.05。(4)Western-blotting分析细胞中Bcl-2蛋白表达，呈浓度依赖性的上调，而Bax蛋白的表达和caspase-3蛋白活性呈浓度依赖性下降。　　结论：(1)迷迭香酸可以拮抗H2O2诱导的内皮细胞凋亡；(2)迷迭香酸抑制内皮细胞凋亡与激活Bcl-2活性有关。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

前言

实验材料

实验方法

实验结果

1.血管内皮细胞凋亡模型

2.迷迭香酸对H2O3诱导的内皮细胞凋亡的影响

3.迷迭香酸拮抗H2O2诱导内皮细胞凋亡的作用机制

讨论

结论

参考文献

附录 主要英文缩略语索引

综述 迷迭香酸的研究进展

致谢