肠球菌对氟喹诺酮类药物的主动外排泵EmeA与耐药关系的研究

摘要

目的:检测肠球菌临床分离株对3种氟喹诺酮类药物(FQs)的敏感性,探讨肠球菌对FQs产生耐药性机制,研究主动外排泵EmeA在肠球菌的分布以及表达情况,为临床合理使用抗菌药物、控制肠球菌感染、研发新一代抗肠球菌药物提供理论依据。
　　方法:随时收集临床送检标本,按全国临床检验操作规程[1]肠球菌检测方法分离、培养、鉴定和药敏试验。用二倍琼脂稀释法测定临床分离株肠球菌对3种氟喹诺酮类药物的最低抑菌浓度(MIC),以及利血平对 MIC值的影响。用聚合酶链反应(PCR)检测编码主动外排泵EmeA的基因emeA在肠球菌临床株的分布,随机挑选一emeA基因阳性菌株,将其PCR产物纯化后测序,并对测序结果用Blast软件进行同源性分析,探讨肠球菌耐药与emeA基因的关系。用逆转录(RT)-PCR测定emeA基因阳性菌株中emeA mRNA的表达水平。
　　结果:临床标本中分离得到肠球菌共112株,其中粪肠球菌82株,占73.2％;屎肠球菌28株,占25.0%;鸟肠球菌、坚韧肠球菌各1株,各占0.9%。肠球菌主要分离于尿液66株(58.9%)、痰液31株(24.1%)、伤口分泌物10株(11.6%),而其他标本仅有5株(5.4%)。
　　3种氟喹诺酮类药物的抗肠球菌活性(MIC50,MIC90)从强到弱为:加替沙星分别为1mg/L,4mg/L、司帕沙星为2mg/L,8mg/L和左氧氟沙星为2mg/L,32mg/L。
　　112株临床株肠球菌中47株为耐药菌,占42.0%,其中10株对3种氟喹诺酮均耐药,占耐药菌21.3%;24株对2种耐药,占51.0%,13株对1种耐药,占27.7%。应用利血平后,112株临床分离株中40株为耐药菌,占35.7%,其中7株对3种氟喹诺酮均耐药,占耐药菌17.5%;18株对2种耐药,占45%;15株对1种耐药,占37.5%。肠球菌对3种氟喹诺酮的耐药率都降低:左氧氟沙星耐药率从42.0%降至28.6%,司帕沙星耐药率从33.0%降至24.1%,加替沙星耐药率从9.9%降至5.3%。利血平使左氧氟沙星MIC90从32mg/L降至16 mg/L;使司帕沙星MIC50从2mg/L降至1 mg/L,MIC90从8mg/L降至4 mg/L;使加替沙星MIC50从1mg/L降至0.5 mg/L,而MIC90从4mg/L降至1 mg/L。
　　用PCR法从112株肠球菌中扩增出57株emeA基因,emeA基因总阳性率50.9%。在对左氧氟沙星、司帕沙星和加替沙星耐药的肠球菌中,检出的emeA基因阳性率分别为67.9%、67.8%、80.0%,敏感株的emeA基因阳性率分别为33.9%、32.1%、44.6%。将emeA片段测序结果与GenBank登录序列在碱基和核苷酸水平进行同源性比较,同源性达到100%。用逆转录(RT)-PCR法并设置内参照,研究了它们肠球菌emeA基因的mRNA表达水平,耐药组emeA基因mRNA表达量与内参灰度比值的平均值为1.485,而敏感组的灰度比值平均值为1.099(P<0.01)。
　　结论:
　　1.肠球菌在临床感染中,以粪肠球菌最常见,其次是屎肠球菌,其他种类肠球菌较少见;感染标本中,以尿液中分离率最高。
　　2.肠球菌临床株对氟喹诺酮类药物均有不同程度耐药现象。氟喹诺酮类药物对肠球菌的抑菌活性从强到弱依次为:加替沙星、司帕沙星、左氧氟沙星。
　　3.在112株肠球菌临床分离标本中,基因emeA的总阳性率为50.9%;耐药株的emeA基因阳性率高于敏感株,并且耐菌株的emeA基因mRNA表达水平显著高于敏感株。
　　4.主动外排泵抑制剂利血平可提高肠球菌对氟喹诺酮药物的敏感性。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

实 验 材 料

1. 抗菌药粉

2. 培养基

3. 化学试剂

4. 酶类

5. Marker、引物及其它

6.试剂盒

7. 仪器设备

实 验 方 法

1. 肠球菌对氟喹诺酮类药物的敏感性

2. 肠球菌对抗菌药物的敏感性试验

3. PCR扩增肠球菌emeA基因

4. PCR产物的回收及emeA基因的测序鉴定

5. RT-PCR检测基因emeA的mRNA表达水平

实 验 结 果

1. 112株肠球菌在临床标本中的分布

2. 肠球菌的药敏试验

3.emeA基因的扩增

4. emeA基因的存在状况与肠球菌耐药的关系

5. emeA基因的mRNA表达水平

讨论

结论

参考文献

综述

成 果 目 录

致谢