DADS诱导HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达基因的分离与克隆

摘要

研究目的:DADS(Diallyl disulfide,DADS)是从大蒜中分离出的一种脂溶性单体有机硫化合物,可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期停滞等方式抑制多种肿瘤细胞的生长。DADS能诱导HL-60细胞的分化和凋亡,导致HL-60细胞增殖周期阻滞在G2/M期。本试验分别用经DADS处理、无DADS处理的人白血病HL-60细胞的mRNA做为tester、driver,构建DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达文库,试图从中分离出与G2/M期阻滞相关基因。用RACE克隆来源于DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达文库的新EST的3、5端未知序列,为进一步研究其结构和功能打下基础。
　　方法:分别以DADS处理的HL-60细胞和未处理的人白血病HL-60细胞的mRNA做为tester和driver,用SSH构建DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达cDNA文库。随机挑选正向阳性克隆,PCR检测插入片段,将含插入片段的克隆测序。Blastn分析差异cDNA片段的同源性。
　　用RT-PCR验证WT-1047在有无DADS处理时人白血病HL-60细胞中表达的差异性。获得的ESTs依据其高度保守序列设计用于扩增的寡聚核苷酸引物,用设计的3引物和RACE试剂盒提供的5共用引物,进行3cDNA末端快速扩增,扩增产物克隆入pGEM-T Easy载体中,阳性克隆测序分析后,所得EST片段进行生物信息学分析。
　　结果:构建了DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达cDNA文库,其中包含120个正向的阳性克隆和100个反向的阳性克隆。51个随机正向阳性克隆测序、比较同源性,发现7个新的EST片段,已经在GenBank中登录。其中WT-1047仅在DADS处理人白血病HL-60细胞中有表达;采用3RACE克隆出WT-1047的3端一段序列。
　　结论:构建了DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达cDNA文库,该文库含有120个正向阳性克隆和100个反向阳性克隆;获得了7个新的EST;克隆了一条与DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞新的相关基因。

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主要缩略语英文索引

前言

第一部分 DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达cDNA文库的建立

实验材料

实验方法

实验结果

第二部分 WT－1047的cDNA全长的克隆

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

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