肺炎嗜衣原体CPAF重组蛋白诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子和凋亡的研究

摘要

目的：构建肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae，Cpn)蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease-like activity factor，CPAF)的重组表达体，在E.coli XL1-Blue中诱导表达，纯化表达产物，研究该重组蛋白在体外诱导人单核细胞表达并产生前炎症细胞因子TNF-α和IL-6的水平及诱导细胞凋亡作用，为进一步探讨Cpn感染致病的分子机制提供实验依据。 方法：构建重组质粒，然后转化至宿主菌E.coli XL1-Blue中进行诱导表达，利用SDS-PAGE和Western-Blot进行分析和鉴定表达产物，复性后用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)琼脂糖凝胶FF纯化重组蛋白，A280紫外分光光度法测定纯化蛋白浓度.用鲎试验法检测纯化后蛋白的内毒素，用ToxinEraser纯化柱去除内毒素。用不同浓度的Cpn CPAF刺激THP-1细胞，ELISA检测经刺激后的THP-1细胞产生的TNF-α和IL-6水平；以WST-1法检测经CPAF处理后THP-1细胞的增生或抑制作用，用Hoechst33258荧光染色、DNA片段化分析、AnnexinV-FITC-PI染色法检测细胞凋亡情况。 结果：构建了重组质粒pGEX6p-2/CPAF，并在E.coliXL1-Blue菌中高效表达出Mr约为94kDa的Cpn CPAF目的蛋白，超声裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达，经GST琼脂糖凝胶FF纯化获得纯度在95％以上的重组蛋白。Cpn CPAF能诱导THP-1细胞表达TNF-α和IL-6，并以时间、剂量依赖方式刺激细胞分泌前炎症细胞因子TNF-α和IL-6，当GST-CPAF的浓度为2μg/mL时产生的TNF-α和IL-6量最多，分别为(584.48±22.12)pg/mL、(59.33±5.89)pg/mL；当Cpn CPAF刺激THP-1细胞24h时产生的TNF-α和IL-6量则达到高峰。另外Cpn CPAF以剂量依赖方式抑制THP-1细胞增殖。当10μg/mLCPAF处理THP-1细胞48h后，形态学上，细胞表现为皱缩、核碎裂、细胞起泡及凋亡小体等凋亡特征；当Cpn CPAF刺激THP-1细胞24h后，即可诱导其发生凋亡；当10μg/mL Cpn CPAF处理THP-1细胞48h后，即可检测到典型的凋亡梯状带。 结论： 1.成功构建了pGEX6p-2/CPAF原核表达重组体，将其转化至E.coliXL1-Blue后能高效表达出一相对分子质量约94kDa的GST-CPAF重组蛋白； 2.Cpn CPAF重组蛋白能诱导THP-1细胞表达并分泌前炎症细胞因子TNF-α和IL-6； 3.Cpn CPAF重组蛋白既能抑制THP-1增殖，又能诱导其凋亡。