核内M-CSF与Mcm7分子间的相互作用及其在细胞周期中的变化

摘要

目的：建立核内稳定表达巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的细胞系，验证核内M-CSF与微小染色体维持蛋白7(Mcm7)分子间的相互作用，探讨M-CSF与DNA特定区域(c-myc基因)结合，确定M-CSF和Mcm7分子间相互作用在细胞周期中的变化。 方法：将M-CSF核定位重组表达载体pCMV/nuc/M-CSF、空载体pCMV/nuc/myc及阳性对照载体pCMV/nuc/GFP分别转染HeLa细胞，经G418筛选并扩增阳性克隆后，用RT-PCR、Western blotting证实阳性克隆有M-CSF的表达；用染色质免疫沉淀技术检测核内M-CSF在染色质DNA特定区域的定位；双轮染色质免疫沉淀法检测M-CSF-Mcm7复合物是否与染色质结合；胸苷双阻断法和染色质免疫沉淀法观察M-CSF在c-myc基因DNA复制区起始区(198bp)和转录起始区(350bp)定位分布的细胞周期时相变化。 结果：RT-PCR、Western blotting结果显示转染pCMV/nuc/M-CSF的HeLa细胞(命名为：HeLa-M细胞)能稳定表达M-CSF mRNA和蛋白，提示：一个核内稳定表达M-CSF的细胞系一成功建立。染色质免疫沉淀与PCR显示：核内M-CSF能与DNA特定区域(c-myc基因)复制起始区结合(198bp)，但不与c-myc基因转录起始区(350bp)结合；双轮染色质免疫沉淀和PCR显示：c-myc基因复制起始区，和c-myc基因转录起始区存在染色质结合形式的M-CSF-Mcm7复合物；双轮染色质免疫沉淀和蛋白质免疫印迹结果显示：HeLa-M细胞中的M-CSF能被抗Mcm7抗体沉淀；胸苷双阻断法同步化HeLa-M细胞，染色质免疫沉淀和PCR结果显示，M-CSF在细胞周期2.5，5，7.5，15，17.5，20，22.5h出现在c-myc基因DNA复制区起始区(198bp)；双轮染色质免疫沉淀结果显示在HeLa细胞周期的2.5，5，7.5，15，17.5，20，22.5h，M-CSF与Mcm7同时出现c-myc基因DNA复制区起始区(198bp)，M-CSF与Mcm7在HeLa细胞周期的7.5，10，12.5，15，17.5h，同时出现于c-myc基因转录起始区(350bp)。 结论：成功建立了一个核内稳定表达M-CSF的HeLa细胞系；核内M-CSF与DNA特定区域(c-myc基因)复制起始区结合；在c-myc基因DNA复制区起始区(198bp)和c-myc基因转录起始区(350bp)存在染色质结合形式的M-CSF-Mcm7复合物；M-CSF-Mcm7复合物在细胞周期不同时相存在于c-myc基因复制区起始区和转录起始区。