慢性阻塞性肺疾病中转录因子ATF3/ATF4和KLF2在Nrf2/γ-GCS通路中的作用及意义

摘要

【目的】研究转录因子ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2及γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠及患者肺组织中的表达变化关系;探讨 ATF3、ATF4、KLF2与Nrf2蛋白之间的相互作用,以及对γ-GCS-HS基因表达的影响;探索它们在COPD发病中的可能作用,为COPD的防治提供新的理论依据。
　　【方法】实验分两部分。(1)动物试验部分:将22只雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组和COPD模型组,每组11只。采用每日熏香烟和两次气管内滴入脂多糖(LPS)复制 COPD大鼠模型。检测各组大鼠肺功能并观察大鼠肺组织病理形态学改变;原位杂交和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA的表达。免疫组化和免疫印迹(Western blot)分别检测ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表达水平。并同时利用免疫共沉淀法(CO-IP)探讨ATF3、ATF4、KLF2与Nrf2蛋白之间的相互作用。(2)临床试验部分:肺癌患者手术切除肺组织标本40例,所有患者术前均询问病史,进行体检、X线胸片或肺部 CT和肺功能检测,其中COPD组和对照组各20例。原位杂交分析各组患者肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA水平,免疫组化检测肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白的表达。
　　【结果】
　　1.动物试验结果
　　(1)大鼠肺功能指标(FEV0.3、FEV0.3/FVC％、PEF)在COPD组较对照组明显降低(P均<0.01)。COPD组大鼠肺部病理改变符合COPD的形态学改变。
　　(2) ROS含量在COPD组较对照组显著增高(P<0.01),γ-GCS-HS活性在COPD组较对照组显著升高(P<0.01)。
　　(3)原位杂交结果显示:ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA在两组大鼠肺组织中的表达部位基本一致,主要见于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、平滑肌细胞以及血管内皮细胞,且ATF3、ATF4、KLF2、γ-GCS-HS mRNA在COPD组显著高于对照组(P均<0.05)但两组Nrf2 mRNA比较无明显差异(P>0.05)。RT-PCR结果与原位杂交结果一致。
　　(4)免疫组化结果显示:ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS主要表达于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞,小血管平滑肌中亦有少许表达。ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2在COPD组以胞核表达为主,γ-GCS-HS在胞浆胞核均有免疫着色,其差异具显著性(P均<0.05)。Western blotting结果与免疫组化结果一致(P均<0.05)。
　　(5)免疫共沉淀显示:在 Nrf2抗体捕获的免疫沉淀中,ATF3、ATF4、KLF2抗体均可杂交出明显的蛋白条带,且COPD组明显增强(P<0.01)。
　　(6) SPSS16.0软件行直线相关分析:大鼠肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2蛋白表达与γ-GCS-HS mRNA、蛋白及酶活性均呈正相关(均P<0.05);ATF3、ATF4、KLF2蛋白表达与Nrf2蛋白表达均呈正相关(均P<0.05);ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2蛋白表达与 ROS呈正相关(均P<0.05)。
　　2.临床试验结果
　　(1) COPD患者肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、γ-GCS-HS mRNA呈强阳性表达,较对照组显著升高(均P<0.01),而Nrf2 mRNA在两组肺组织中均呈阳性表达,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
　　(2) ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白在COPD患者肺组织中呈强阳性表达,较对照组明显增高(均P<0.01)。
　　(3) SPSS16.0软件行直线相关分析:ATF3、ATF4、KLF2蛋白表达与Nrf2蛋白、γ-GCS-HS mRNA及蛋白表达均呈明显正相关(均P<0.01),而与Nrf2 mRNA表达无明显相关性(P>0.05)。另肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表达与FEV1(%)、FEV1/FVC(%)均呈正相关(均P<0.01)。
　　【结论】
　　1.在COPD氧化应激状况下,体内重要抗氧化酶γ-GCS可代偿性上调,而Nrf2是γ-GCS表达上调的关键性转录调控子,可增加GSH合成,降低ROS,对抗氧化损伤。
　　2.在慢性阻塞性肺疾病发病过程中,氧化应激诱导转录因子ATF3、ATF4过表达可能与Nrf2的转录调控有关。
　　3. ATF3、ATF4可与Nrf2形成异二聚体,可能通过增加Nrf2的转录活性,上调γ-GCS mRNA和蛋白质的表达而发挥抗氧化保护作用。
　　4. KLF2可能通过增加 Nrf2的表达,活化并促进 Nrf2核积聚,上调γ-GCS mRNA和酶活性表达,对抗氧化应激。

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主要缩略词

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前言

材 料 与 方 法

一. 主要试剂及来源

二. 主要仪器

三. 实验动物

四. 临床标本及相关资料

五．实验方法

1. 大鼠COPD模型的建立

2. 大鼠肺功能的测定

3. 组织标本的留取

5.γ-GCS-HS 活性测定

6. ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS的原位杂交检测和结果分析

7. 免疫组化检测肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS蛋白的表达

8. Western blot检测ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白质的表达

实 验 结 果

一 动物试验部分

1．大鼠肺功能及肺组织病理改变

2. 肺组织中ROS含量和γ-GCS-HS 活性测定结果

3. 大鼠肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA的表达

4. 肺组织匀浆中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA的表达

5. 肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS 蛋白表达

7. 肺组织匀浆中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS 蛋白表达

8.免疫共沉淀检测肺组织中Nrf2与ATF3、ATF4、KLF2蛋白之间的相互作用

9．相关性分析

二 临床试验部分

1．临床肺标本获取患者资料

2. 各组患者肺组织形态学改变

3. 临床肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HSmRNA的表达

4. 临床肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表达

5. 相关性分析

讨论

结论

参考文献

附图

综述

硕士期间撰写论文