miRNA let-7a在肝内胆管癌组织中的表达及其对胆管癌细胞生物学行为影响的实验研究

摘要

miRNA let-7a在肝内胆管癌组织中的表达及其对胆管癌细胞生物学行为影响的实验研究
　　研究背景与目的：
　　肝内胆管细胞癌是起源于肝内胆管二级分支以上的一种原发于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，或称为肝内型胆管癌。根据包括美国、欧洲和日本在内的多国流行病学调查发现，肝内胆管细胞癌的发病率呈现出明显的上升趋势，目前在肝脏原发性肿瘤中，其发病率已仅次于肝细胞性肝癌，约占10％～15%。肝内胆管细胞癌的特点是起病隐匿、发展迅速、恶性程度高，且由于缺乏理想的早期诊断标志物，确诊时已多属中、晚期，因此手术切除率低。尽管多年来不断研究和探索肝内胆管细胞癌的发生发展机制，也取得了一些诊治方面的进展，但总体来说其预后仍然较差，因此加强对肝内胆管癌细胞分子生物学特性的研究和探索新的治疗方式对改善胆管癌患者的预后具有重要意义。
　　微小RNA（miRNA）是一组内源性的非编码RNA，广泛存在于真核生物中，长度为18-25个核苷酸，在进化中高度保守，其通过与mRNA3`非编码区（3`UTRs）的结合调控特异靶基因的表达，从而在细胞增殖、分化、调亡等人体生理过程中起重要作用。通过疾病的miRNA表达谱与正常表达谱之间的对比，研究证实miRNA通过多种机制参与人类重大疾病(如恶性肿瘤、艾滋病、心血管系统疾病、神经系统疾病等)的发生、发展。目前对miRNA的研究已经成为国际上肿瘤生物学领域的一个新热点。通过众多的研究发现，在人类恶性肿瘤中miRNA兼有“癌基因”和“抑癌基因”的双重作用；其既可作为癌基因，下调抑癌基因的表达，也可作为抑癌基因，下调原癌基因的活性。miRNA突变、缺失或表达水平的异常都对人类肿瘤的发生发展产生重要影响。Lethal-7（let-7）是人类发现的第二个miRNA，在人类基因组中存在9个由let-7同源基因家族编码的miRNA分子，根据既往对肺癌、乳腺癌、肝癌和结肠癌等多种人类恶性肿瘤的研究报道，它能调控细胞的分化和增殖时序进而在恶性肿瘤组织中起到抑癌基因的作用，同时也是一种潜在的早期癌症诊断标志物和疾病预后指标。
　　目前国内外关于let-7a与肝内胆管细胞癌的研究报道较少，其在胆管癌的发生发展中的作用和机制尚不明确，本实验通过实时荧光定量聚合酶链式反应技术（Real-time PCR）检测let-7a在肝内胆管癌手术切除标本和正常胆管组织中的表达，同时采用化学合成的具有增强内源性 miRNA功能的双链RNA（miRNA mimics）和具有抑制特异 miRNA功能的单链 RNA（miRNA inhibitor）转染人肝内胆管癌HuCCT-1细胞株，观察增强和抑制内源性let-7a对胆管癌细胞增殖、凋亡和克隆形成率的影响，探讨其在肝内胆管细胞癌中的作用和为探索新的治疗方法提供实验和理论依据。
　　方法：
　　1.收集湖南省人民医院2012年3月至10月间16例手术切除肝内胆管细胞癌标本和9例正常胆管组织标本，应用Real-time PCR方法检测所有标本中let-7a的表达，分析正常胆管组织和胆管癌组织中let-7a表达的差异,并探讨let-7a的表达量与肝内胆管细胞癌患者临床病理指标之间的关系。
　　2.培养人肝内胆管癌 HuCCT-1细胞株，体外化学方法合成 let-7a mimics、let-7a inhibitor和各自阴性对照，通过Lipofectamin2000转染试剂分别转染入人肝内胆管癌HuCCT-1细胞，设立未转染细胞为空白对照组，其余转染细胞为 let-7a过表达组、let-7a抑制组、过表达阴性对照组和抑制阴性对照组，采用荧光显微镜直接观察评价转染效果，于细胞转染后的第24和48小时以Real-time PCR方法分别检测五组细胞内let-7a表达量的差异，评价干扰效果。
　　3.通过细胞增殖实验（CCK8）、流式细胞术检测细胞凋亡率以及克隆形成实验来观察增强和抑制let-7a对胆管癌细胞生物学行为的影响。
　　结果：
　　1.let-7a在肝内胆管癌组织中的表达量为（0.36±0.21），而其在正常胆管组织中的表达量为（9.53±4.06），其差异有显著的统计学意义（P=0.00）；let-7a的低表达与淋巴结转移（P=0.001）和组织学分化程度（P=0.00）有关，与患者性别、年龄、门静脉浸润、肿瘤大小之间无统计学意义（P＞0.05）。
　　2.let-7a mimics、inhibitor和各自阴性对照能被高效转染入人肝内胆管癌细胞株HuCCT-1。通过let-7a mimics转染胆管癌细胞株HuCCT-1可显著增强细胞内let-7a的表达（P=0.00），通过let-7a inhibitor转染HuCCT-1细胞株可有效抑制细胞内let-7a的表达量（P=0.00），转染各自阴性对照试剂的对照组细胞和HuCCT-1细胞自然生长的空白对照组之间，let-7a的表达量无统计学差异（P＞0.05）。
　　3.CCK8实验中增强细胞内let-7a表达可抑制胆管癌细胞HuCCT-1的增殖（P=0.00），而抑制let-7a的表达可促进胆管癌细胞HuCCT-1的增殖（P=0.00），过表达阴性对照组、抑制阴性对照组和空白对照组之间细胞增殖差异无统计学意义（P＞0.05）；上调let-7a的表达可明显促进HuCCT-1细胞的凋亡（P=0.00），抑制let-7a的表达则可明显抑制HuCCT-1细胞的凋亡率（P=0.00），两组阴性对照和空白对照组细胞之间凋亡率的差异无统计学意义（P＞0.05）；过表达let-7a的胆管癌HuCCT-1细胞其克隆形成率明显降低（P<0.05）而抑制let-7a表达的HuCCT-1细胞其克隆形成率明显升高（P<0.05），空白对照组和过表达阴性对照组、抑制阴性对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.let-7a在肝内胆管癌组织中的表达明显下调，let-7a的下调可能在肝内胆管癌的发生发展中起到促进作用。
　　2.Let-7a的低表达提示患者存在较高的淋巴结转移率和较低的组织学分化程度。
　　3.let-7a mimics可以明显增强人肝内胆管癌细胞株HuCCT-1中let-7a的表达，let-7a inhibitor可以显著抑制肝内胆管癌细胞株HuCCT-1中let-7a的表达。
　　4.let-7a在人肝内胆管细胞癌中能起到抑癌基因的作用。

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引言

第一部分 Let-7a在肝内胆管癌组织中的表达及意义

1.实验材料

1.1 实验标本：

1.2 实验试剂：

1.3主要实验仪器：

2.试验方法

2.1 标本组织中总RNA的提取

2.2 quantitive Real-time PCR(qRT-PCR ) 分析

2.3 统计学处理

3 实验结果

3.1 组织RNA提取质量的检测

3.2 qRT-PCR检测let-7a在正常胆管组织和肝内胆管癌组织中的表达差异

3.3 let-7a的表达与肝内胆管癌临床病理参数之间的关系

4 讨论

第二部分 let-7a对肝内胆管癌细胞生物学行为的影响

1 实验材料

1.1 细胞株

1.2 实验试剂

1.3 主要实验仪器

1.4 主要配置试剂

2 实验方法

2.1 细胞培养及传代

2.2 细胞冻存

2.3 Let-7a基因mimics及inhibitor片段的设计与合成

2.4 细胞转染

2.5 转染效率评价

2.6 CCK8增殖实验

2.7 平板克隆实验

2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.9 统计分析

3 结果

3.1 转染效率评价

3.2 CCK8细胞增殖实验结果

3.3 平板克隆形成实验结果

3.4 细胞凋亡实验结果

4 讨论

结论

参考文献

综述

在读期间发表的主要学术论文

致谢