念珠菌与新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系的建立

摘要

目的:
　　旨在建立实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR）检测体系，以实现快速、准确、特异、定量地检测包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌以及新型隐球菌在内的临床侵袭性真菌感染常见的病原菌，为临床医生对该疾病的诊断、治疗提供指导。
　　方法:
　　于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购买真菌标准株，培养后制成浓度约为107CFU/ml真菌标准株混悬液，10倍梯度稀释成107~100CFU/ml，用于真菌实时荧光定量 PCR（FQ-PCR）检测体系的建立。在基因库(NCBI)中分别下载多种真菌、细菌、病毒以及人类基因序列，通过比对找出五种真菌：白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和新型隐球菌各自的特异性区域，利用Primer Premier5.0和Beacon Designer7.7设计引物探针。通过对比一步裂解法、Lyticase酶消化法、玻璃珠破壁法、Biospin膜吸附法、磁珠法、浓缩裂解法、浓缩裂解结合加热等方法提取真菌DNA的效率及扩增效果，寻找真菌DNA提取的最佳方法。同时通过对Mg2+、dNTP、引物及探针浓度等参数进行优化，筛选出各自的最佳反应体系，并验证反应体系的特异性、重复性，并分析各自反应的灵敏度，对临床分离出的86例真菌病原菌进行检测。
　　结果:
　　成功设计白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和新型隐球菌的特异性引物探针，念珠菌及新型隐球菌的DNA提取效率以及荧光定量PCR效果以浓缩裂解结合加热的方法最佳，扩增曲线呈典型“S”形。在最佳反应体系下，五种真菌的PCR反应体系均能分别对各自对应的真菌进行特异性扩增，而与其他真菌、细菌、病毒以及人类基因组之间无交叉反应。每一个反应体系不同底物浓度与Ct值之间成良好的线性关系，R2均在0.995以上。白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌以及新型隐球菌反应体系检测的灵敏度为5CFU/ml，热带念珠菌灵敏度为50CFU/ml，所有反应体系稳定性、重复性好，批内、批间重复5次实验，所得每一种反应体系Ct值批内、批间的变异系数均小于5％（在0.22%至3.19%之间）。所建立的5种反应体系对临床分离菌株检测的结果阳性率为100%，并且无交叉反应发生。
　　结论:
　　浓缩裂解结合加热法是适用于实时荧光定量PCR的成功、高效的真菌DNA提取方法。成功设计了特异性检测白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和新型隐球菌的引物探针，并建立了实时荧光定量 PCR检测体系。临床常见的五种致病真菌病原菌全部检出，实验建立的PCR检测体系结果可靠，拥有广泛作为临床侵袭性真菌感染诊断有效手段的巨大潜能。

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中文摘要

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中英文缩略语名词对照表

前言

实验材料

1．实验材料

2．实验仪器

实验方法

1．标准株培养及制备

2．核酸提取

3．引物探针设计

4．PCR扩增产物测序

5．PCR反应体系优化

6．特异性试验

7．重复性试验

8．线性范围测定试验和定量标准曲线制备

9．灵敏度分析试验

10．Hex内标分析

11．数据统计分析

12．临床检测

实验结果

1．引物探针设计

2．标准株培养结果

3．PCR产物测序结果

4．DNA提取方法比较

5．特异性试验

6．反应体系优化结果

7．重复性试验

8．线性范围测定试验及标准曲线的建立

9．灵敏度分析试验

10．内标加入比较结果

11．临床真菌检测结果

讨论

结论

参考文献

综述

攻读硕士学位期间发表的论文及参与的课题

致谢