新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系的建立

摘要

目的:寻找适用于新型隐球菌DNA提取的方法,建立实时荧光定量PCR (FQ-PCR)检测体系,以实现快速、准确、特异、定量地检测临床常见真菌病原菌新型隐球菌,为临床医生对该疾病的诊断、治疗提供指导.方法:于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购买真菌标准株,培养后制成浓度约为107CFU/ml真菌标准株混悬液,用于新型隐球菌实时荧光定量PCR (FQ-PCR)检测体系的建立.在基因库(NCBI)中分别下载多种真菌、细菌、病毒以及人类基因序列,通过比对找出新型隐球菌特异性区域,利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 7.7设计引物探针.通过对比一步裂解法、Lyticase酶消化法、玻璃珠破壁法、Biospin膜吸附法、磁珠法、浓缩裂解法、浓缩裂解结合加热等方法提取新型隐球菌DNA的效率及扩增效果,寻找新型隐球菌DNA提取的最佳方法.同时通过对Mg2+、dNTP、引物及探针浓度等参数进行优化,筛选出最佳反应体系,并验证反应体系的特异性、重复性,并分析其灵敏度,对临床分离出的4例真菌病原菌进行检测.结果:成功设计新型隐球菌的特异性引物探针，新型隐球菌的DNA提取效率以及荧光定量PCR效果以浓缩裂解结合加热的方法最佳，扩增曲线呈典型“S”形。在最佳反应体系下，新型隐球菌的PCR反应体系仅能对新型隐球菌进行特异性扩增，而与其他真菌、细菌、病毒以及人类基因组之间无交叉反应。不同底物浓度与Ct值之间成良好的线性关系，R2为0.999。反应体系检测的灵敏度为5CFU/ml，反应体系稳定性、重复性好，批内、批间重复5次实验，所得反应体系Ct值批内、批间的变异系数均小于5%。结论:浓缩裂解结合加热法是适用于实时荧光定量PCR的成功、高效的新型隐球菌DNA提取方法。成功设计了特异性检测新型隐球菌的引物探针，并建立了新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系。临床病原菌全部检出，实验建立的PCR检测体系结果可靠，拥有广泛作为临床新型隐球菌感染诊断有效手段的巨大潜能。