人乳头瘤病毒16型E2蛋白与Daxx相互作用及作用的结构域

摘要

目的：研究人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白与Daxx的相互作用，为进一步探讨两种蛋白质相互作用在HPV16致癌中的作用及其机制提供实验参考依据。
　　方法：
　　(1)用PRIMER5.0软件分别设计HPV16E2及其结构域基因片段(氨基酸1-201、202-365和249-365)特异性引物，并引入EcoRI、BamHI酶切位点，PCR扩增目的基因。分别用EcoRI和BamHI双酶切PCR产物和质粒p G A D T7，纯化回收酶切产物， T4连接酶连接后，转化E.coli JM109，筛选阳性克隆。经酶切鉴定及DNA序列分析，构建酵母菌表达载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD。
　　(2)应用 LiAc法，分别将诱饵质粒 pGBKT7/Daxx与猎物质粒 pGADT7和pGADT7/HPV16E2转化酵母菌AH109，涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade(单缺)固体培养基上，30℃培养2-4d，检测诱饵质粒和猎物质粒对酵母菌AH109的自激活作用。
　　(3)将质粒分为7组，它们分别是 A组(pGADT7+pGBKT7)、B组(pGADT7-T+pGBKT7-Lam)、C组(pGADT7-T+pGBKT7-p53)、D组(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2)、E组(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2TAD)、F组(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2H-DBD)和G组(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2DBD)。将每组质粒共转化酵母菌AH109，转化菌分别接种于SD/-Trp-Leu固体培养基，30℃培养2~4d，待平板上长出菌落后，接种单个菌落于SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上，30℃培养2~4d，观察酵母菌的生长情况，分析Daxx与HPV16E2相互作用及其氨基酸结构域。
　　(4)将pcDNA3.1/Daxx用BamHI酶切，收获约2.2kb片段，连入载体pet28a相同位点，筛选阳性克隆，构建6His-Daxx融合蛋白原核细胞表达载体pet28a/Daxx。分别培养E.coli BL21（含pet28a/Daxx或pGEX6p-1/HPV16E2质粒），IPTG诱导表达目的产物6His-Daxx或GST-HPV16 E2，Ni-NTA或GST纯化试验盒分别纯化目的蛋白， SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定融合蛋白。
　　(5)取6His-Daxx和GST-HPV16E2融合蛋白纯化产物各0.5μg混合，加入抗GST或抗His抗体及500μl裂解缓冲液，进行免疫共沉淀试验（COIP）和Western blot；培养Caski细胞48h，收集细胞裂解液，经蛋白质A/G琼脂糖处理后，收集上清液，进行COIP和Western blot；IP抗体为抗Daxx或抗HPV16E2抗体，Western blot抗体为抗HPV16E2或抗Daxx抗体。
　　(6)培养Caski细胞，利用间接免疫荧光试验和图像软件观察并分析HPV16E2蛋白和Daxx在Caski细胞内分布与定位或共定位。
　　结果：
　　(1) DNA序列分析结果显示HPV16E2及其结构域基因片段均正确地连入pGADT7载体，即构建了酵母菌表达载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD。
　　(2)转化了诱饵质粒pGBKT7、pGBKT7/Daxx的酵母菌AH109，在SD/-Trp固体培养基上可见菌落生长，而在SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade未见菌落生长。转化了猎物质粒pGADT7、pGADT7/HPV16E2的酵母菌AH109，在SD/-Leu固体培养基上可见菌落生长，在SD/-Trp、SD/-His、SD/-Ade培养板上未见菌落生长，即诱饵质粒和猎物质粒均无自激活作用。
　　(3) A～G组质粒转化的酵母菌在SD/-Trp-Leu平板上均可见菌落生长。在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上，只有C、D、E组转化菌生长，A、B、F、G组未见菌落生长。
　　(4)酶切鉴定结果显示，Daxx正确地连入pet28a载体，即构建了Daxx原核表达载体pet28a/Daxx。在E.Coli BL21，IPTG诱导其表达了6His-Daxx融合蛋白。COIP和Western blot结果显示，在约90kDa与70kDa有条带，即HPV16E2与Daxx在细胞外发生了结合反应。
　　(5)利用Caski细胞裂解上清液，COIP和Western blot结果显示，在约80kDa与60kDa出现条带，即HPV16E2与Daxx在细胞内发生了结合反应。
　　(6)在Caski细胞，表达红色信号的HPV16E2和表达绿色信号的Daxx主要分布于Caski细胞胞浆，少数分布于细胞核；当红色信号与绿色信号重叠时，出现黄色信号。
　　结论：
　　(1)载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD能在酵母菌中表达相应的目的蛋白；pet28a/Daxx能在E.coli BL21中表达融合蛋白6His-Daxx。
　　(2) HPV16E2蛋白能在细胞内外结合Daxx；HPV16E2通过N端结构域（TAD）与Daxx结合并发生相互作用。
　　(3)HPV16E2蛋白与Daxx主要分布于Caski细胞胞浆，且共定位胞浆与胞核。

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主要英文缩略语索引

中文摘要

英文摘要

1．前言

2 实验材料

2.1 菌种与质粒

2.2 主要实验仪器及产家

2.3 主要实验试剂及产家

2.4其它

3. 实验方法

3.1引物设计

3.2 E.coli JM109菌种复苏

3.3 pcDNA3.1/HPV16 E2质粒的制备

3.4 扩增HPV16 E2及其TAD、H-DBD、DBD片段

3.5 PCR产物的纯化与回收

3.6 HPV16E2、TAD、H-DBD、DBD及pGADT7双酶切

3.7 酶切产物回收

3.8 HPV16 E2及其基因片段和pGADT7双酶切产物的连接

3.9 感受态E.coli JM109的制备

3.10 重组质粒的转化

3.11真核表达载体的鉴定

3.12 基因测序鉴定

3.13 菌种保存

3.14 酵母双杂交系统相关质粒菌种的复苏及制备

3.15 AH109菌种表型验证

3.16 诱饵质粒与猎物质粒的自激活检测

3.17 原核表达载体pet28a-Daxx及pGEX6p-1-HPV16E2的构建

3.18 GST-HPV16E2和pet28a-Daxx融合蛋白在E.coli BL21中的诱导表达及存在状态鉴定

3.19 融合蛋白的大规模诱导表达及纯化

3.20 HPV16E2与Daxx在细胞外的结合反应

3.21HPV16E2与Daxx在细胞内的结合反应

3.22 间接免疫荧光试验

4 实验结果

4.1 真 核 载 体 pGADT7/HPV16E2 、 pGADT7/HPV16E2TAD 、pGADT7/HPV16E2H-DBD、pGADT7/HPV16E2DBD的构建

4.2 HPV16 E2蛋白及其结构域与Daxx相互作用

4.3原核载体的构建及蛋白质的诱导表达和纯化

4.4 Daxx与HPV16 E2在细胞内外的结合反应

4.5 HPV16E2与Daxx在Caski细胞内的分布与定位

5.讨论

结论

参考文献

附录

综述

读研期间课题与论文

致谢