SIRT1通过BDNF-TrkB通路介导硫化氢抗同型半胱氨酸诱导的认知功能损伤

摘要

【研究背景与目的】：
　　高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia, Hhcy)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)一个重要、独立的高危因素。继NO和CO之后的第三种气体神经调质-硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)，对神经突触可塑性和增进记忆能力方面具有调节作用。我们以往的研究结果表明 H2S可拮抗同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)对学习记忆和认知功能的损伤作用，但作用机理尚未阐明清楚。
　　目前有研究表明BDNF-TrkB(brain-derived neurotrophic factor-Tropomyosin receptor kinase B)通路和SIRT1(Silentinformation regulator1)对学习与记忆具有重要的调节作用。我们的前期研究发现H2S可上调神经细胞 BDNF和SIRT1的表达。因此，我们推测 H2S抗 Hcy损害学习记忆和认知功能的作用可能与其调节 BDNF-TrkB通路和SIRT1有关。
　　本实验采用对SD大鼠单侧侧脑室注射 Hcy染毒从而建立 AD的动物模型，予K252a(TrkB受体特异性拮抗剂)或Sirtinol(SIRT1特异性拮抗剂)预处理阻断相应通路，探讨阻断 BDNF-TrkB通路和SIRT1能否逆转 H2S对Hcy损害 SD大鼠学习记忆和认知功能的拮抗作用，以明确 BDNF-TrkB通路和SIRT1对H2S抗Hcy损害学习记忆和认知功能的介导作用。
　　【方法】：
　　Y-maze、新物体识别和Morris水迷宫检测大鼠学习记忆和认知能力；Western blotting方法检测海马组织中SIRT1和BDNF蛋白的表达。
　　【结果】：
　　1. BDNF-TrkB通路介导H2S抗Hcy损害认知功能的作用
　　K252a(1μg/d)侧脑室给药阻断BDNF-TrkB通路，30 min后予以H2S供体NaHS(5.6 mg/kg/d)腹腔注射，连续2 d后，再连续7d联合单侧侧脑室微量注射4μL的Hcy(0.6μmol/d)。采用Y-maze、新物体识别和Morris水迷宫检测大鼠学习记忆和认知能力。
　　Y-maze实验结果显示K252a(1μg)阻断BDNF-TrkB通路逆转了H2S(5.6 mg/kg)对Hcy(0.6μmol)降低大鼠交替率的改善作用；新物体识别实验显示K252a(1μg)阻断BDNF-TrkB通路逆转了H2S(NaHS,5.6 mg/kg)改善Hcy(0.6μmol)组大鼠新物体识别指数的作用。
　　Morris水迷宫获得性训练期第四天结果显示Hcy(0.6μmol)组大鼠寻找平台的潜伏期较对照组显著延长，且其游泳路线更曲折、复杂，NaHS(5.6 mg/kg)预处理可改善Hcy延长大鼠潜伏期的作用，而事先予以K252a(1μg)阻断BDNF-TrkB通路可逆转 H2S对Hcy延长大鼠潜伏期的改善作用。
　　Morris水迷宫空间搜索实验显示Hcy(0.6μmol)组大鼠穿过原平台的次数较对照组减少，且在目标象限时间比和中环游泳时间比均减少，NaHS(5.6 mg/kg)预处理可改善Hcy减少大鼠穿过原平台次数的作用，而事先予以K252a(1μg)阻断BDNF-TrkB通路可逆转 H2S对Hcy损害大鼠学习记忆的改善作用。
　　上述结果提示：阻断 BDNF-TrkB通路可逆转 H2S拮抗 Hcy对SD大鼠学习记忆和认知功能的损害作用。
　　2. SIRT1介导H2S抗Hcy损害认知功能的作用
　　SD大鼠腹腔注射NaHS(1.68,5.6 mg/kg/d)2 d后，单侧侧脑室微量注射4μL Hcy(0.6μmol/d)，连续7 d。采用Western blotting方法检测海马组织中SIRT1蛋白的表达。结果显示，Hcy对SIRT1蛋白表达的下调作用可被 H2S逆转。表明 H2S对SIRT1表达具有上调作用。
　　Sirtinol(10 nmol/d)侧脑室给药阻断SIRT1，30 min后予以H2S供体NaHS(5.6 mg/kg/d)腹腔注射，连续2 d后，再连续7d联合单侧侧脑室微量注射4μL的Hcy(0.6μmol)。采用Y-maze、新物体识别和Morris水迷宫检测大鼠学习记忆和认知能力。
　　Y-maze实验结果显示Sirtinol(10 nmol)抑制SIRT1表达逆转了H2S(NaHS,5.6 mg/kg)对Hcy(0.6μmol)降低大鼠交替率的改善作用；新物体识别实验显示Sirtinol(10 nmol)抑制SIRT1表达逆转了H2S(NaHS,5.6 mg/kg)改善Hcy(0.6μmol)组大鼠新物体识别指数的作用。
　　Morris水迷宫定位航行实验第四天结果提示 Sirtinol抑制 SIRT1表达逆转了H2S(NaHS,5.6 mg/kg)对Hcy(0.6μmol)延长大鼠潜伏期的改善作用；空间搜索实验结果提示Sirtinol抑制SIRT1表达逆转了H2S(NaHS,5.6 mg/kg)对Hcy(0.6μmol)减少大鼠穿过原平台次数和在目标象限时间比和中环游泳时间比的改善作用。
　　上述结果提示：阻断 SIRT1可逆转 H2S拮抗 Hcy对SD大鼠学习记忆和认知功能的损害作用。
　　3. SIRT1抑制剂Sirtinol能够逆转H2S对Hcy下调BDNF表达的改善作用
　　提前用Sirtinol(10 nmol/d)阻断SIRT1，WB法检测BDNF表达情况。结果显示，阻断 SIRT1表达后可逆转 H2S对Hcy下调 BDNF表达的改善作用。表明， SIRT1通过 BDNF-TrkB通路介导 H2S拮抗 Hcy对SD大鼠学习记忆和认知功能的损害作用。
　　【结论】：
　　H2S通过 SIRT1上调 BDNF-TrkB通路拮抗 Hcy对SD大鼠学习记忆和认知功能的损害作用。

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前言

1. 同型半胱氨酸 (Hcy) 的神经毒性

2. 硫化氢可拮抗同型半胱氨酸诱导的神经毒性作用

3. 脑源性神经营养因子 (BDNF) 具有神经保护效应

4. SIRT1的神经保护作用

4. 本课题的科学假说和研究思路

材料与方法

1.主要试剂和仪器

2. 实验试剂和药品的配制方法

3.实验方法

4.统计分析

结果

1. BDNF-TrkB 通路介导 H2S 抗 Hcy 损害认知功能的作用

2. SIRT1介导 H2S 抗Hcy 损害认知功能的作用

3. SIRT1 抑制剂 Sirtinol 能够逆转 H2S 对 Hcy 下调 BDNF 表达的改善作用

讨论

1. BDNF-TrkB 通路介导 H2S 抗 Hcy 损害认知功能的作用

2. SIRT1 介导 H2S 抗 Hcy 损害认知功能的作用

3. SIRT1 抑制剂 Sirtinol 能够逆转 H2S 对 Hcy 下调 BDNF 表达的改善作用

结论

参考文献

综述

参考文献

硕士期间发表论文

致谢