玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因启动子的克隆与功能分析

摘要

目前，基因工程中存在的主要问题是外源基因的表达水平、表达部位等问题，因此，作为调控基因表达关键元件之一的启动子的研究便成为基因工程研究的关键。启动子有组成型启动子(constitutivepromoter)、组织特异性启动子(tissue-specificpromoter)和诱导型启动子(induciblepromoter)三种。迄今为止，植物表达载体中应用最广泛的是CaMV35S组成型启动子，它导致外源基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达，不但造成能源的浪费还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。这就使人们越发注重特异表达启动子的研究和应用，使启动子在特定的组织和一定的发育时期启动基因表达，既保证了外源基因在植物体内的有效发挥又减少了对植物的不良影响。虽然已有许多特异启动子被相继克隆成功，但是较理想的、真正能应用于生产实践的组织特异性启动子并不多，种子特异性启动子更少。本文克隆的玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子是种子特异启动子。玉米淀粉分支酶(SBE)是玉米淀粉合成过程中的关键调控酶之一，有sbeⅠ、sbeⅡa和sbeⅡb三种同工酶，其中sbeⅡb对胚乳直链淀粉含量的影响最大。因此，提高sbeⅡb的表达水平就成为当今植物基因工程中的研究热点。目前，只检索到关于大麦sbeⅡb基因启动子的研究，对于玉米sbeⅡb启动子研究的报导未见发表。此论文旨在用组织特异性启动子sbeⅡb去代替CaMV35S组成型启动子，构建新的植物表达载体，启动玉米淀粉分支酶基因在植物体内的特异表达，为提高玉米淀粉中直链淀粉的含量及改变玉米淀粉品质奠定基础。 本研究分别以普通玉米及黄、白粘玉米的基因组DNA为模板，根据已知玉米sbeⅡb基因启动子序列(GenBank：AF072725)，设计一对引物，通过LA-PCR扩增出sbeⅡb基因启动子的部分片段。因为黄粘玉米“吉糯1号”的目的片段较特异，所以取其基因组DNA的PCR产物作为进一步实验的材料，再将此片段插入pMD18-TVector克隆载体获得重组质粒。重组质粒经大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选，得到17个白斑，32个蓝斑。提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定，结果所得片段大小和目的片段一致。鉴定后的菌株送交大连宝生物公司测序并利用DNAMAN生物软件进行分析。结果表明所克隆的插入片段长为934bp，与预期设计的大小一致，仅有14个碱基发生突变，同源性达到98.52％。序列中发现高等植物启动子所特有的基本核心序列TATA-box(TATAATA)和CAAT-box。作为真核启动子基本调控元件的GC盒竟有6个拷贝。此外，序列中出现了许多种子特异表达所须的特殊调控元件，如在-865bp处出现的胚乳表达顺式作用元件GCN4(TGAGTTTC)；在-113bp处的种子特异作用因子RY-element(CATGCA)；在-279bp位点出现的胚乳特异启动子必须元件EM-motif。序列多次出现AT-rich序列，应该对特异表达起一定的增强作用。另外，在-687bp位置发现ACGT元件，此元件对胚乳表达有重要作用。 将重组质粒和植物表达载体pBI121经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切，通过T4DNA连接酶构建植物表达载体pSBE-GUS，即以组织特异性sbeⅡb基因启动子代替组成型CaMV35S启动子，构建在GUS的上游。酶切鉴定得知sbeⅡb基因特异启动子已成功插入到植物表达载体中。将植物表达载体pSBE-GUS转入大肠杆菌感受态细胞中增殖培养后提取质粒，再利用冻融法将表达质粒转入根癌农杆菌EHA105和EHA101中得到含pSBE-GUS的菌株，并利用农杆菌介导法将带有sbeⅡb基因启动子的菌株转化烟草，同时用未转基因的烟草作阴性对照。转基因烟草叶片共培养2天后，转入含有Kan和Cef抗生素的选择培养基上进行筛选培养，结果获得5株转pSBE-GUS基因植株。我们发现菌液(OD值)在0.5-0.6之间，浸染6min时效果最好，且EHA105的转化效率高于EHA101。对5株转基因苗进行PCR检测，以未转基因的植株作为阴性对照，结果5株再生苗扩增出与目的片段大小一致的条带。对PCR反应呈阳性的转基因植株作Southern杂交检测，同时以未转基因的烟草作阴性对照，以BamHⅠ和HindⅢ双酶切pSBE-GUS质粒为阳性对照。杂交结果显示有4株有明显杂交信号，说明目的基因已成功整合到基因组中。 为了验证所扩增的启动子是否具有启动子功能，属何种类型的启动子且表达量多少，我们对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析。结果表明，转基因烟草的叶片仅有少量蓝斑出现，而根和茎部并未看到蓝斑，但烟草种子有大量蓝斑显出。由此初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。为了更深入的分析sbeⅡb基因启动子的功能，再对烟草的根、茎、叶及种子进行GUS荧光检测分析。结果表明，烟草的根和茎部检测不到GUS酶活性，叶片中有微弱的荧光信号，但种子中有很高的GUS酶活性，荧光信号较强。进一步验证sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中的特异表达。本研究不但能促进sbeⅡb基因时空表达的顺式作用元件的探索，也为植物基因工程中表达载体的改造奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

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前言

1玉米淀粉分支酶基因SBE Ⅱ b的性质及研究现状

1.1淀粉生物合成

1.2淀粉分支酶(SBEⅡ b)的性质及研究现状

2启动子(promoter)的性质、分类及研究现状

2.1启动子性质

2.2启动子分类及各自的研究进展

3玉米淀粉分支酶基因启动子的研究现状

4本研究的目的、意义

5创新点

材料与方法

1材料

1.1植物材料

1.2试剂

1.3培养基

1.4菌株和质粒

1.5 PCR引物

1.6主要仪器设备

2方法

2.1核酸的提取

2.2 PCR扩增

2.3 PCR扩增产物电泳和DNA片段回收纯化

2.4目的片段连入T载体

2.5大肠杆菌感受态的制备和转化

2.6重组质粒的细菌菌落的鉴定

2.7克隆片段的测序分析

2.8植物表达载体pSBE-GUS的构建

2.9表达质粒转化农杆菌

2.10农杆菌介导转化烟草

2.11烟草再生苗的抗性和PCR检测

2.12转基因烟草的Southern杂交检测

2.13 GUS活性瞬时表达的检测

结果

1 玉米淀粉分支酶(SBE Ⅱ b)基因启动子的分离和克隆

1.1基因组DNA的提取

1.2引物设计和PCR扩增

1.3插XT载体

1.4 PCR扩增片段的序列分析

1.5表达载体的构建及鉴定

2农杆菌介导转化烟草

2.1烟草的预分化培养

2.2浸染烟草及共培养

2.3选择培养和生根培养

2.4再生植株的鉴定

讨论

1.SBEⅡ b基因启动子的克隆

2.SBE Ⅱ b启动子的测序分析

3.表达载体的构建和转化

4.转基因烟草各部位组织的GUS活性分析

结论

1克隆了玉米SBEⅡ b基因上游启动子片段

2构建了植物表达载体pSBE-GUS

3获得了转基因烟草

4启动子性质及活性的鉴定

参考文献(References)

附录 英文缩略词表

致谢