二烯丙基二硫下调uPAR抑制人结肠癌细胞增殖、迁移与侵袭

摘要

目的:近年来,发现尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator,uPAR)参与多种肿瘤的调控,对肿瘤细胞的增殖和侵袭的意义引起了广泛关注。我们先前证明二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)可诱导人结肠癌SW480细胞增殖抑制与细胞周期 G2/M期阻滞,其机制不明。本研究旨在研究 DADS与沉默uPAR基因对人结肠癌SW480细胞uPAR表达及其信号通路的影响,以阐明其抗肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭的分子机制。
　　方法:根据uPAR基因序列设计miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4干扰序列,并设计1条非特异性序列作为阴性对照。将含靶向uPAR的miRNA的质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR-uPAR转染人结肠癌SW480细胞,建立稳定细胞系,通过Western blot验证其对uPAR表达的抑制作用;MTT比色法检测DADS作用和干扰uPAR后的SW480细胞增殖的影响;Transwell实验和划痕实验分别观察DADS作用和干扰uPAR后SW480细胞侵袭和迁移能力的改变;免疫组化检测DADS作用和干扰uPAR后的SW480细胞的uPAR的表达;RT-PCR、Western blot分别检测DADS作用和干扰uPAR后的SW480细胞uPAR的mRNA与蛋白表达。Western blot分别检测ERK、Fra-1、TIMP-3、MMP9、uPA的蛋白表达;RT-PCR分别检测TIMP-3和uPA的mRNA表达。RT-PCR、Western blot分别检测DADS作用SW480细胞vimentin和E-Cadherin的mRNA与蛋白表达。
　　结果:
　　1.DADS对人结肠癌SW480细胞uPAR蛋白表达的影响
　　45mg·L-1 DADS分别处理SW480细胞0、12、24、48 h后,Western blot结果显示,uPAR蛋白的表达水平呈时间依赖性下降。免疫细胞化学显示,uPAR蛋白在DADS处理0h组细胞胞膜和胞浆上表达呈强阳性,处理12、24、48 h后表达明显减弱。表明DADS可呈时间依赖性抑制SW480细胞uPAR蛋白表达。2.DADS下调uPAR对SW480细胞迁移与侵袭的影响
　　划痕实验结果显示,DADS处理结肠癌SW480细胞0、12、24、48 h后,观察它们的划痕愈合情况,DADS处理0h组划痕愈合显著快于12、24、48 h组,证明DADS处理后SW480细胞迁移能力被抑制(P<0.05),呈时间依赖性下降。Transwell实验显示,DADS处理SW480细胞后的体外侵袭能力被抑制,呈时间依赖性下降。
　　3.RNA干扰uPAR对DADS抑制SW480细胞增殖、迁移与侵袭的影响
　　pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-uPAR-miRN干扰质粒提取后琼脂糖电泳跑胶结果表示质粒提取纯度较高,倒置荧光显微镜下可见转染细胞发绿色荧光。Western blot结果显示,与未转染组相比,转染uPAR-miRNA后SW480细胞uPAR蛋白表达降低(P<0.05)。
　　Western blot结果显示,转染uPAR-miRNA1的SW480细胞其uPAR蛋白表达水平与阴性转染组相比分别下降70.11％、18.12%、72.32%、15.32%,第3转染组对蛋白表达的抑制最明显(P<0.05)。后续实验均采用uPAR-miRNA3质粒作为实验对象。
　　绘制生长曲线表明,48h后uPAR沉默组与未转染组和阴性转染组比较,细胞增殖明显抑制(P<0.05),而未转染组与阴性转染组相比差异无显著性意义(P>0.05)。表明沉默组较未转染组和阴性转染组生长速度减慢。MTT结果显示,干扰uPAR表达可抑制细胞增殖。DADS处理沉默组细胞24h后发现,细胞增殖抑制率明显高于DADS处理的未转染组和阴性转染组(P<0.05),48h、72h和96h后也是一样的结果,提示沉默uPAR可增强DADS的抑制细胞增殖作用。
　　划痕实验结果显示,沉默组与未转染细胞组和DADS处理组作比较,取0h、24h和48h观察划痕愈合情况,沉默组和DADS处理组较未转染组划痕愈合显著变慢,证明沉默SW480细胞uPAR及DADS处理后的SW480细胞迁移能力被抑制(P<0.05)。Transwell实验显示,DADS处理和将uPAR基因沉默可降低人结肠癌SW480细胞的体外侵袭能力(P<0.05)。
　　RT-PCR和Western blot和免疫组化结果均显示,沉默组和45 mg L-1 DADS分别处理未转染组、阴性转染组和转染组24 h后,uPAR表达均明显低于阴性转染组和未转染组(P<0.05)。表明DADS和沉默uPAR可抑制uPAR表达。
　　4.DADS通过下调uPAR对ERK1-Fra-1-uPA信号通路的影响
　　RT-PCR和Western blot结果均显示,uPAR沉默组和45mg L-1 DADS处理阴性转染组,ERK1、Fra-1、uPA、MMP-9表达均明显低于阴性转染组和未转染组(P<0.05),而TIMP-3表达均明显增高(P<0.05)。表明DADS和沉默uPAR基因可抑制ERK1、Fra-1、uPA、MMP-9表达和上调TIMP-3表达。
　　5.DADS与沉默uPAR基因对EMT的影响。
　　Western blot和免疫细胞化学结果均显示,uPAR沉默组、45 mg L-1 DADS处理未干扰组与 DADS处理干扰组较未干扰组 vimentin表达明显降低,而E-cadherin显著升高(P<0.05)。表明DADS和沉默uPAR基因可下调vimentin和上调E-cadherin。
　　结论:
　　1.DADS可下调uPAR抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭。
　　2.沉默uPAR基因可增强DADS抑制SW480细胞增殖、迁移与侵袭能力。
　　3.DADS可通过ERK1-Fra-1-uPA/uPAR-MMP-9/TIMP-3信号通路下调ERK1、Fra-1、MMP-9、uPA、uPAR和上调TIMP-3抑制SW480细胞迁移与侵袭。
　　4.DADS和沉默uPAR可下调vimentin和上调E-Cadherin逆转EMT。

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前言

材料与方法

1实验材料

2. 实验方法

结果

1. DADS对人结肠癌SW480细胞uPAR表达的影响

2. DADS下调uPAR对SW480细胞生物学特性的影响

3. RNA干扰uPAR对DADS抑制SW480细胞增殖、迁移与侵袭的影响

4. 与uPAR基因相关的信号通路的检测

5. DADS及沉默uPAR逆转EMT

讨论

结论

参考文献

综述

读硕期间撰写的论文

主要缩略英文索引

致谢