亲环素A对ox-LDL诱导的RAW264.7细胞中NF-κB、M-CSF和ZFP36表达的影响

摘要

一、亲环素A、NF-κB、M-CSF和ZFP36在氧化低密度脂蛋白诱导的RAW264.7细胞中表达的改变
　　目的：观察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理RAW264.7细胞不同时间后，亲环素A(CypA)、核转录因子 B(NF-κB)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和锌指蛋白36(ZFP36)在细胞中表达之间存在的关系。
　　方法：实验过程中过首先使用 ox-LDL孵育 RAW264.7细胞不同的时间(0,4,8,12h)，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，检测亲环素A mRNA的表达的变化，采用蛋白免疫印迹(Western blot)的方法分别检测亲环素 A、NF-κB和ZFP36的蛋白表达的改变；酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测M-CSF表达的改变。
　　结果：Ox-LDL与RAW264.7细胞共同孵育，与对照组相比，ox-LDL处理细胞4h、8h和12h组，RT-PCR检测发现亲环素A的mRNA表达均明显增强，差异有显著性(P<0.05)，尤以8h时表达量最高。Western blot检测的亲环素A蛋白表达的结果也呈现相似的趋势，故在后续实验中，ox-LDL处理细胞的时间选择8h。同步检测的NF-κB p65的蛋白表达结果显示亲环素A一致的趋势，与对照组相比，ox-LDL处理细胞4h、8h和12h组，蛋白表达均明显增强，在处理8h时表达量最高，差异有显著性(P<0.05)；而 I-κBα蛋白质的表达趋势恰好与NF-κB p65的蛋白表达结果相反，各组较对照组表达均明显降低，在处理8h组表达量最低，差异有显著性(P<0.05)。Western-blot检测还发现ZFP36的蛋白表达也在ox-LDL处理细胞4h、8h和12h后明显减弱，而且8h组表达改变程度最明显，差异有显著性(P<0.05)。ELISA检测结果显示细胞内 M-CSF的表达明显增强，在处理8h时表达量最高，差异有显著性(P<0.05)。
　　小结：Ox-LDL可促进RAW264.7细胞中亲环素 A、NF-κB和M-CSF的表达，而降低细胞中ZFP36的蛋白表达。
　　二、亲环素A siRNA对氧化低密度脂蛋白诱导的RAW264.7细胞中NF-κB、M-CSF和ZFP36的表达的影响
　　目的：通过亲环素A siRNA沉默RAW264.7细胞中亲环素A的表达，观察细胞中NF-κB、M-CSF和ZFP36表达水平的改变。
　　方法：按Invitrogen公司提供的脂质体LipofectamineTM2000转染程序，将亲环素 A siRNA转入 RAW264.7细胞，RT-PCR和Western-blot分别检测亲环素 A mRNA和蛋白表达的改变；在第一部分实验的基础上，选择50mg/L和8h作为ox-LDL处理细胞的浓度和时间，Western blot检测NF-κB p65、I-κBα和ZFP36蛋白的表达改变；ELISA检测M-CSF蛋白表达的改变。
　　结果 RT-PCR和Western-blot检测发现转染组亲环素A mRNA和蛋白质的表达较对照组均明显降低，差异有显著性(P<0.05)，可以用于后续实验。经ox-LDL处理的亲环素A siRNA转染RAW264.7细胞组与对照组相比，NF-κB p65蛋白的表达明显降低，而 I-κBα蛋白的表达明显增加，差异均有显著性(P<0.05)。Western blot检测，经ox-LDL处理的亲环素A siRNA转染组ZFP36蛋白质的表达也明显增加，差异有显著性(P<0.05)，ELISA检测则显示M-CSF的表达降低，差异有显著性(P<0.05)。
　　小结：亲环素A siRNA可延缓ox-LDL诱导的RAW264.7细胞中NF-κB、M-CSF蛋白表达的上调和ZFP36蛋白表达的下调。
　　结论：
　　1.Ox-LDL可促进RAW264.7细胞中亲环素 A、NF-κB和M-CSF的表达和降低细胞中ZFP36的蛋白表达。
　　2.亲环素A siRNA可延缓ox-LDL诱导的RAW264.7细胞中NF-κB、M-CSF蛋白表达的上调和ZFP36蛋白表达的下调。

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