白桦脂酸通过PKC/MAPK/C-Fos信号途径下调氧化应激诱导的巨噬细胞LPL表达

摘要

背景：动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病发生的最主要病理学与病理生理学基础，以巨噬细胞脂质蓄积为特征。脂蛋白酯酶（LPL）是脂质降解的关键酶，已证实巨噬细胞源性的LPL能促进巨噬细胞脂质蓄积，进而促进AS的发生发展。氧化应激与AS的发生密切相关，研究表明氧化应激可以上调巨噬细胞源性LPL的表达，促进巨噬细胞脂质蓄积。白桦脂酸（BA）是一种五环三萜类化合物，最新研究表明BA具有抗氧化应激效应。本研究探讨BA对ROS诱导的巨噬细胞 LPL表达及活性的影响，以及进一步对巨噬细胞脂质蓄积的影响，并研究其作用的主要机制。
　　方法：RAW264.7巨噬细胞予以不同浓度H2O2（0,50,100,200μM）处理18h或加入200μM H2O2孵育细胞时间（0,612,18,24h），运用荧光探针DCFH-DA检测 ROS的表达；实时定量PCR和Western Blot检测LPL mRNA和蛋白水平，试剂盒检测 LPL活性。不同浓度 BA（0,0.5,1,2μg/ml）预处理24h及 BA（1μg/ml）预处理细胞不同时间（0,12,24,48h）后，再加入H2O2（200μM）处理18h，分别检测LPL的表达及其活性情况。酶法定量检测细胞内总胆固醇（TC）及甘油三酯(TC)含量及油红O染色法检测巨噬细胞脂质蓄积情况。不同浓度BA预处理H2O2诱导的巨噬细胞，检测 ROS的表达，反映BA抗氧化应激效应。BA预处理H2O2诱导的巨噬细胞，用Western blot方法分别检测蛋白激酶C（PKC） 蛋白水平、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化蛋白水平，以及c-Fos磷酸化蛋白水平。外源性分别加入BA、PKC抑制剂、MAPK抑制剂及siRNA c-Fos，分别检测它们对H2O2诱导的LPL的表达及其活性情况；以及检测加入PKC抑制剂后MAPK及 c-Fos磷酸化蛋白水平表达情况，加入MAPK抑制剂后c-Fos磷酸化蛋白水平表达情况。
　　结果： H2O2呈剂量和时间依赖性诱导ROS产生及上调巨噬细胞LPL的生成及活性。BA呈浓度及时间依赖性下调H2O2诱导的巨噬细胞源性LPL表达及活性，并减少LPL介导的巨噬细胞内TC及TG含量，并且油红O染色法检测细胞内脂滴蓄积也减少。BA呈浓度依赖性减少H2O2诱导的ROS生成。进一步发现，BA可以分别抑制H2O2诱导的膜PKC蛋白表达、ERK1/2磷酸化蛋白表达，以及c-Fos磷酸化蛋白表达。外源性分别加入相应的抑制剂或siRNA分别抑制PKC、MAPK及c-Fos表达，与加入BA的结果一致，均能抑制H2O2诱导的巨噬细胞源性LPL表达及活性。我们还发现，加入PKC抑制剂后抑制了H2O2诱导的MAPK及c-Fos蛋白磷酸化，加入MAPK抑制剂后取消了H2O2诱导的c-Fos蛋白磷酸化。
　　结论：在巨噬细胞中， BA发挥其抗氧化应激效应，通过抑制 ROS诱导的PKC/MAPK/c-Fos信号途径，下调氧化应激诱导的巨噬细胞源性 LPL表达及活性，减少巨噬细胞脂质蓄积。

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引言

主要实验材料和仪器

主要实验技术与方法

实 验 结 果

讨论

结论

参考文献

附录

文 献 综 述

硕士期间发表的论文

致谢

基 金 资 助