基因芯片分析EB病毒LMP1诱导鼻咽癌干细胞增殖的机制

摘要

目的：鼻咽癌（NPC）的发病与EB病毒感染密切相关，EB病毒编码的潜伏性膜蛋白1（LMP1）是其重要致瘤蛋白。本研究旨在探讨LMP1羧基末端CTAR2的TRADD活性区在鼻咽癌干细胞SP18增殖中的作用及机制，为揭示EBV的致瘤机理提供实验依据。
　　方法：培养产RV-LMP1和RV-LMP1TRADD逆病毒的PA317细胞，收集细胞上清，分别感染鼻咽癌干细胞SP18，经G418筛选后融合克隆，免疫细胞化学染色检测LMP1和 LMP1TRADD蛋白的表达，建立表达 LMP1及 CTAR2突变 LMP1（LMP1TRADD）的SP18细胞系，即SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞。然后绘制细胞生长曲线、平皿克隆实验、软琼脂集落实验和流式细胞术观察LMP1TRADD对 SP18增殖的影响。然后，采用基因芯片检测 SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞间的差异表达基因，并选用RT-PCR验证部分基因的表达。
　　结果：
　　1、免疫细胞化学染色结果显示，建立的SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞均在细胞膜和浆中表达LMP1蛋白。
　　2、绘制的细胞生长曲线结果显示，SP18-LMP1细胞生长速度较SP18-LMP1TRADD细胞快。
　　3、软琼脂集落和平皿克隆结果显示，SP18-LMP1细胞较SP18-LMP1TRADD细胞形成的集落数多，体积大。
　　4、流式细胞术检测结果显示，SP18-LMP1细胞S期和G2期细胞比例较SP18-LMP1TRADD细胞多，细胞增殖指数高。
　　5、经基因芯片共检测出428个差异表达基因，其中与细胞增殖相关基因76个（上调基因38个，下调基因38个）。
　　6、RT-PCR验证部分基因的表达情况与基因芯片检测结果基本一致。
　　结论：
　　1、TRADD活性区是LMP1影响SP18细胞增殖的重要功能活性位点。
　　2、TRADD活性区通过提高S期和G2期细胞比例，增加细胞的增殖指数，影响SP18细胞的增殖。
　　3、LMP1羧基末端CTAR2的TRADD活性区可能通过影响CYP1A1和NGFR等基因的表达，调节SP18细胞的增殖。

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前言

技术路线

材料

1.1细胞与质粒

1.2试剂与配制

1.3引物

1.4主要仪器设备

方法

2.1细胞培养

2.2 SP18细胞的感染

2.3免疫细胞化学染色

2.4细胞总RNA的抽提

2.5 RT-PCR检测基因表达

2.6绘制生长曲线

2.7平板克隆形成实验

2.8软琼脂集落实验

2.9流式细胞仪（FCM）检测

2.10基因芯片检测

2.11统计学处理

结果

3.1 SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞系

3.2细胞生长曲线观察SP18-LMP1TRADD细胞的生长特点

3.3平皿克隆形成实验观察SP18-LMP1TRADD细胞的生长增殖能力

3.4软琼脂集落实验观察SP18-LMP1TRADD细胞的增殖能力

3.5 FCM检测SP18-LMP1TRADD细胞的增殖指数

3.6 基因芯片检测LMP1-TRADD活性区影响SP18细胞增殖的相关基因

3.7 RT-PCR验证部分基因的差异表达

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间主要的研究成果

致谢