应用内质网应激模型评估纳米银的体内体外毒性

摘要

第一部分：
　　目的：探讨纳米银（AgNPs）对小鼠巨噬细胞（RAW264.7）毒性效应的影响，为AgNPs生物安全性的研究提供依据。 方法：将不同浓度的AgNPs（0，6.25，12.5，25，50，60，80μg/mL）和RAW264.7共同培养，8或24 h后采用甲基噻唑基四唑比色法（MTT）法测定各组细胞的活力，选取2.5μg/mL和5μg/mL两个无明显细胞毒性的浓度进行后续研究，检测应激相关基因和蛋白表达的变化；酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养液中炎症因子TNF-α和IL-6的表达。
　　结果：用2.5μg/mL和5μg/mL的AgNPs处理细胞：24 h后相差显微镜下可见纳米颗粒进入细胞内，且5μg/mL组的细胞形态有明显改变；8和24小时后ELISA结果显示IL-6无明显变化，在5μg/mL的24 h处理组TNF-α表达有显著升高，内质网应激相关的基因和蛋白在5μg/mL的24 h处理组表达明显上调。
　　结论：RAW264.7细胞暴露于低剂量的纳米银后表现出明显的应激反应，并且与暴露的剂量和作用的时间存在正相关性；AgNPs的能够进入RAW264.7细胞，可能是其产生毒性效应的必要条件。低剂量的AgNPs会干扰细胞的正常生理功能，长期暴露可能产生不可逆的损伤，应引起高度关注。
　　第二部分：
　　目的：研究纳米银经静脉注射后的主要靶器官分布及应激效应，为评估AgNPs对人体健康和环境的毒性影响提供理论依据。
　　方法：Balb/c小鼠经尾静脉注射不同剂量（0.2、2、5mg/kg）的AgNPs8h后，检测AgNPs在体内各器官的生物分布、内质网应激、氧化应激等，评估小鼠暴露AgNPs后早期毒性效应。
　　结果：应激相关标志性的蛋白质和基因呈剂量依赖性的显著上调，其中在脾、肝、肺、肾中最为明显，并且导致急性毒性反应；表明小鼠暴露于AgNPs后，脾、肝、肺、肾是AgNPs毒性的主要靶器官；心脏和脑中也有AgNPs存在，但本研究并未检测到毒性反应。
　　结论：组织细胞早期暴露于AgNPs后会产生应激反应，如果应激反应逐步增加可以对靶器官造成永久的毒性损害，提示在AgNPs的毒性的评估中需认识到应激相关标志物的重要性。

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第1章 前言

第2章 低剂量纳米银对小鼠巨噬细胞RAW264.7应激效应研究

2.1 引言

2.2材料与方法

2.2.1 材料与试剂

2.2.2仪器

2.2.3 AgNPs的表征

2.2.4 细胞培养及活力检测

2.2.5细胞形态和摄入状态检测

2.2.6 酶联免疫吸附实验（ELISA）

2.2.7 荧光定量PCR分析

2.2.8蛋白质印迹法（Western Blot）

2.2.9数据分析

2.3结果

2.3.1 AgNPs的TEM

2.3.2不同浓度的AgNPs对细胞活力的影响

2.3.3 细胞形态及AgNPs摄入情况

2.3.4 RAW264.7细胞与AgNPs共培养后相关炎症因子表达情况

2.3.5 相关基因的表达情况

2.3.6 AgNPs对内质网应激相关蛋白表达的影响

2.4讨论

2.5结论

第3章 小鼠单次尾静脉注射纳米银后各器官的生物效应研究

3.1 引言

3.2材料与方法

3.2.1 材料与试剂

3.2.2动物处理

3.2.3 反转录和实时定量PCR

3.2.4 蛋白质印迹法

3.2.5病理组织学观察（ HE染色）

3.2.6 ICP-MS检测纳米颗粒的组织摄入量

3.2.7血液学检测

3.2.8 细胞凋亡分析

3.2.9 统计分析方法

3.3 结果

3.3.1 静脉注射AgNPs后的组织分布

3.3.2应激水平的评估

3.3.3 AgNPs引起组织急性毒性损伤

3.4讨论

3.4结论

参考文献

第4章 文献综述:AgNPs对哺乳动物的生物安全性研究进展

4.1前言

4.2 AgNPs的生物效应研究

4.2.1 AgNPs的生物分布

4.2.2潜在的毒性

4.3影响AgNPs毒性的因素

4.3.1AgNPs本身特性

4.3.2环境因素

4.4 结语

参考文献

附录：

主要英文缩略语索引

硕士期间的研究成果

致谢