siRNA沉默DAD1基因表达对肾癌细胞A498增殖与侵袭能力的影响

摘要

背景：
　　肾癌又称肾细胞癌(renal cell carcinooma RCC)是成人肾脏最常见的恶性肿瘤,占成人恶性肿瘤2％-3%,在男性和女性恶性肿瘤中分别排第7位和第9位。在全球范围内,每年大约新发病例27万,其中12万死亡,在我国，肾癌的发病率在泌尿系肿瘤中仅次于膀胱癌,并在过去20年中以每年6%速度递增。病理上肾癌可分为：透明细胞癌、肾乳头状癌、嫌色细胞癌、集合管癌及未分化癌。其中透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma ccRCC)是最常见的病理类型,起源于近曲小管上皮细胞,且易发生转移,占转移性肾癌的80%-85%。肾癌对放疗及化疗均不敏感,手术切除仍是目前最佳的治疗手段,但术后复发率约为20%-40%。由于肾癌的化疗及放疗抵抗性,因此临床上没有有效的术后治疗手段。肾癌作为泌尿科常见疾病，尤其是早期肾癌无特殊临床表现，待出现血尿、腰痛或腹部包块时多已是晚期。肾癌对放疗、化疗均不敏感，临床上一般予行肾癌根治性切除术，但是一旦出现淋巴结转移，即使行根治性淋巴结清扫术，患者生存期也极少超过5年，若出现肝、肺转移或临近器官浸润则预后更差，因此摸索出一条新的治疗方案变的尤为重要。目前靶向沉默目的基因来治疗肿瘤正在被广大研究者所关注，相关研究显示沉默肿瘤细胞中抗凋亡的基因可以促使肿瘤细胞大幅度凋亡，起到治疗肿瘤的作用。
　　目的：
　　合成寡糖基转移酶亚基DAD1的siRNA序列，观察其对人A498肾癌细胞增殖和侵袭能力的影响。
　　方法：
　　设计合成三条DAD1-siRNA干扰片段，采用脂质体法转染人A498肾癌细胞后采用定量PCR和免疫印迹法检测转染前后人A498肾癌细胞中DAD1 mRNA和蛋白的表达变化；MTT检测转染前后A498细胞增殖能力变化；AV-PI流式细胞术检测各组人A498肾癌细胞转染48h后的凋亡率变化；Transwell检测细胞侵袭能力的变化。
　　结果：
　　定量PCR及免疫印迹法检测显示3条siRNA均能有效抑制DAD1 mRNA及蛋白表达(P<0.05)，以DAD1-siRNA1作用效果最显著(P<0.05)。MTT检测显示DAD1-siRNA转染24、48和72h后的人A498肾癌细胞的增殖受到显著抑制(P<0.05)；流式细胞术检测结果显示DAD1-siRNA转染人A498肾癌细胞后凋亡率增加(p<0.05)。Transwell检测结果显示沉默人A498肾癌细胞的DAD1 mRNA表达后，其侵袭能力显著降低(p<0.05)。
　　结论：
　　DAD1-siRNA可明显抑制人A498肾癌细胞的增殖，促进人A498肾癌细胞的凋亡，降低其侵袭能力。

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中英文缩写词表

引言

第一章 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

1.1.2 主要试剂与耗材

1.1.3 引物

1.1.4 DAD1-siRNA序列

1.1.5主要仪器设备

1.1.6实验中所用部分试剂的配制

1.2 实验方法

1.2.1人肾癌细胞A498培养，按照以下步骤进行：

1.2.2 筛选最佳干扰序列

1.2.3 肾癌细胞A498转染最佳DAD1-siRNA后检测其DAD1表达水平以及增殖与侵袭能力

1.2.4肾癌细胞A498转染最佳DAD1-siRNA后检测其DAD1 蛋白表达水平

1.2.5 MTT法测DAD1-siRNA转染后肾癌细胞A498的存活率

1.2.6流式细胞术实验（FCM）检测各组肾癌细胞A498的凋亡

1.2.7 Transwell检测各组肾癌细胞A498的侵袭能力

1.3统计学处理

第二章 实验结果

2.1 细胞培养

2.2 筛选最佳干扰序列

2.2.1 转染各组siRNA后镜检

2.2.2荧光定量PCR检测转染后各组肾癌细胞中DAD1 mRNA的表达水平

2.2.3 各组肾癌细胞中DAD1 蛋白的表达水平

2.3 最佳DAD1-siRNA转染A498细胞后对其DAD1表达以及增殖与侵袭能力的影响

2.3.1荧光定量PCR检测转染后各组肾癌细胞中DAD1 mRNA的表达水平

2.3.2 各组肾癌细胞中DAD1 蛋白的表达水平

2.3.3 MTT法检测转染siRNA后肾癌细胞的增殖能力的变化

2.3.4 DAD1-siRNA转染肾癌细胞后凋亡率的水平

2.3.5 DAD1-siRNA转染肾癌细胞后侵袭能力的变化

第三章 讨 论

第四章 结论与展望

1、研究结论

2、研究展望

参考文献

综述:RNAi技术及其在肾肿瘤基因治疗中的研究进展

成果目录

致谢