KLF2与S1PR1对支气管哮喘豚鼠中性粒细胞迁移的影响

摘要

目的：通过观察支气管哮喘豚鼠模型中性粒细胞中 KLF2、S1PR1的表达情况，探讨KLF2与S1PR1对支气管哮喘豚鼠中性粒细胞的迁移的影响，从而为支气管哮喘的防治提供新的思路。
　　方法：随机将30只豚鼠分为正常对照组、哮喘组、哮喘治疗组，每组各10只；模型组及治疗组通过用10％OVA及FCA致敏，1%OVA雾化激发诱导成支气管哮喘模型，治疗组在雾化激发前腹腔注射地塞米松治疗，对照组用生理盐水替代OVA与模型组同步实验。通过观察各组豚鼠雾化激发后的症状变化及肺组织的病理学改变，并比较各组血及肺泡灌洗液中炎症细胞总数及分类计数，应用肺功能检测各组豚鼠的气道阻力变化。分离各组豚鼠血中性粒细胞，采用 Transwell小室检测各组血中性粒细胞迁移情况，Realtime PCR、Western-blot分别检测各组豚鼠血中性粒细胞中KLF2、S1PR1 mRNA和蛋白的表达，ELISA检测各组肺泡灌洗液及血清中 S1P的蛋白表达情况，免疫荧光检测KLF2在各组豚鼠血中性粒细胞内的表达及定位。
　　结果：1.支气管哮喘动物模型的成功构建
　　（1）各组豚鼠雾化激发后体征变化的观察：在OVA雾化激发期间发现哮喘组豚鼠出现明显的呼吸频率增快、前爪抓鼻、点头呼吸、打喷嚏、咳嗽及腹肌抽搐等典型的哮喘样症状，治疗组豚鼠也出现上述症状但程度较哮喘组明显减轻，正常对照组无异常反应。
　　（2）气道阻力的测定：哮喘组豚鼠的气道阻力随着乙酰甲胆碱浓度的升高而增加，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；哮喘治疗组与哮喘组比较在各浓度刺激下的气道阻力水平下降（P<0.01）。
　　（3）肺组织的病理学观察结果：正常对照组显示支气管、肺泡及肺组织结构完整，炎性细胞浸润少；哮喘组豚鼠显示支气管重塑，管腔变狭窄，肺泡及肺组织结构破坏，管腔内可见较多粘液栓及粘膜皱褶增生、平滑肌细胞明显增厚及大量炎症细胞浸润等典型的病理学改变，其中以中性粒细胞浸润最明显；治疗组基底膜、平滑肌层仍有增厚，但支气管粘膜水肿及炎性细胞浸润明显好转。
　　（4）各组豚鼠BALF液中细胞总数及分类计数：哮喘组豚鼠细胞总数（124.69±7.40、45.07±2.99）及NEU%（22.05±1.57、5.04±1.07）显著高于正常组（P<0.01），治疗组较哮喘组细胞总数（88.29±7.77、124.69±7.40）及NEU%（15.11±1.33、22.05±1.57）下降（P<0.01）。（5）各组豚鼠血白细胞分类计数：哮喘组豚鼠血NEU%显著高于正常组（67.04±5.56、30.74±6.02，P<0.01），治疗组较哮喘组NEU%下降（46.90±5.25、67.04±5.56，P<0.01）。
　　2.各组豚鼠血中性粒细胞KLF2表达及定位、KLF2mRNA和蛋白表达情况
　　免疫荧光、Real-time PCR及Western blot检测结果显示，各组豚鼠血中性粒细胞中KLF2平均光密度、KLF2 mRNA及蛋白表达量：哮喘组<哮喘治疗组<正常组（P均<0.01）。
　　3.各组豚鼠血清及肺泡灌洗液中S1P表达情况
　　ELISA检测结果表明，各组豚鼠血清及肺泡灌洗液中S1P表达：哮喘组>哮喘治疗组>正常组（P均<0.01）。
　　4.各组豚鼠血中性粒细胞S1PR1 mRNA和蛋白表达变化
　　Real-time PCR及Western blot检测结果显示，各组豚鼠血中性粒细胞S1PR1 mRNA及蛋白表达量：哮喘组>哮喘治疗组>正常组（P均<0.01）。
　　5.迁移实验检测各组豚鼠中性粒细胞的迁移情况
　　根据预实验结果选取0.1uM浓度时的S1P进行Transwell实验，结果显示，各组豚鼠血中性粒细胞迁移率：哮喘组>哮喘治疗组>正常组（P均<0.01）。
　　6.KLF2与S1PR1mRNA及蛋白做Pearson相关分析，结果提示二者之间呈负相关。
　　7.KLF2、S1PR1蛋白与各组哮喘豚鼠模型中性粒细胞迁移率做
　　Pearson相关分析，结果提示KLF2与中性粒细胞迁移率呈负相关，S1PR1与中性粒细胞迁移率呈正相关。
　　结论：
　　1.支气管哮喘豚鼠中性粒细胞KLF2表达减少，S1PR1表达上调，经地塞米松治疗后KLF2表达较哮喘组上升，S1PR1表达较哮喘组下降。
　　2.支气管哮喘豚鼠中性粒细胞中KLF2与S1PR1呈负相关性。
　　3.支气管哮喘豚鼠中性粒细胞中KLF2可能通过减弱中性粒细胞的迁移而发挥抗炎作用。
　　4.在支气管哮喘豚鼠模型中，趋化因子S1P与其受体S1PR1结合可能通过促进中性粒细胞的迁移，从而促进哮喘的炎症反应。

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主要缩略词索引

第1章 前 言

第2章 材料与方法

2.1．主要试剂及来源

2.2.主要仪器设备及来源

2.3. 主要溶液配方

2.4. 实验方法

第3章 实验结果

3.1. 支气管哮喘动物模型的成功构建

3.2. 各组豚鼠血清及肺泡灌洗液中S1P的表达情况

3.3.各组豚鼠血中性粒细胞KLF2的平均光密度值变化

3.4. KLF2 mRNA和蛋白的相对表达量

3.5. S1PR1 mRNA相对量及蛋白表达情况

3.6. Transwell实验检测各组豚鼠血中性粒细胞的迁移情况

3.7. 各组豚鼠血中性粒细胞KLF2与S1PR1mRNA及蛋白比较

第4章 讨 论

第5章 结 论

参考文献

附图

综述:1-磷酸鞘氨醇与肺部疾病的研究进展

硕士期间发表的论文

致谢