单细胞筛选人源HBsAb可变区基因序列及乙肝疫苗免疫后PBMCs转录组分析

摘要

目的：克隆全人源乙型肝炎病毒表面抗体可变区序列，研究机体对于乙肝疫苗的免疫应答反应，为筛选全人源乙肝抗体、更好的预防治疗慢性乙型肝炎提供基础。
　　方法：(1)20μg乙肝疫苗强化免疫1名乙肝表面抗体阳性的健康志愿者，7 d后，检测其乙肝表面抗体滴度大于1000mIU/ml，采集30 ml肝素抗凝血，采用流式细胞仪分选出 CD19+/CD27+/IgG+细胞群，挑选96个单细胞，置于20μl单细胞裂解液中，采用混合引物，单细胞 RT-PCR获得重链、轻链可变区序列，将 PCR产物纯化后克隆至pMD?19-T载体，进行测序，对测序结果采用DNA Star5.0 MegAlign和IgBLAST进行相似性和同源性分析。(2)分离3名志愿者接种乙肝疫苗前后外周血单个核细胞，提取总 RNA，检测质量合格后进行基因表达谱分析，对测序原始结果过滤得到clean数据，随后进行差异表达基因分析、GO富集分析及KEGG信号通路分析。
　　结果：(1)成功筛选出12个阳性抗体分泌细胞，12个阳性细胞的轻链和重链PCR产物序列具有很高的同源性。(2)得到829个差异表达基因，对差异基因进行GO富集分析，发现差异表达基因主要参与的生物过程是脂肪酰基 CoA还原酶（醇形成）活性、铁离子转运、蛋白复合物结合、二价铁离子跨膜转运活性等；KEGG信号通路分析显示，差异表达基因主要参与Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子相互作用受体、NF-Kappa B信号通路等。
　　结论：(1)扩增得到了可能的特异性 HBsAb重链、轻链可变区基因序列；(2)初步得到了可能参与乙肝疫苗免疫应答过程的重要基因和调控通路。

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第一章前言

1.1 研究背景及其理论与实际意义

1.2 抗体的结构和功能

1.3 单克隆抗体的研究进展概括

1.4 数字基因表达谱技术概括

1.5 本研究课题的意义及主要研究内容

1.6 技术路线

第二章单细胞筛选全人源HBsAb可变区基因序列

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 本章小结

第三章乙肝疫苗免疫后PBMCs转录组分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 本章小结

讨论

结论

参考文献

文献综述：全人源单克隆抗体制备技术的研究进展

成果目录

致谢