常氧及低氧状态下,Survivin调控ROCK-1促进人肺动脉平滑肌细胞增殖的研究

摘要

目的：
　　1)观察RhoA蛋白1(Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK-1)在体外培养的人肺动脉平滑肌细胞(Human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)中的表达；
　　2）探讨促进HPASMCs增殖的相关机制中，生存素(Survivin)、ROCK-1二者之间的调控关系。
　　方法：
　　1.取离体人肺周围的正常组织,体外培养至第3-8代。将细胞分组为如下7组：低氧0h（即常氧，37℃，21％O2，5%CO2）组、低氧（37℃、5%CO2、5%O2、90%N2）0.5h组、低氧1h组、低氧2h组、低氧4h组、低氧8h组、低氧12h组，用实时荧光定量 PCR(Quantitative realtime-PCR)检测细胞内ROCK-1 mRNA的表达水平,然后用western blotting和免疫荧光检测ROCK-1蛋白质表达的变化，CCK8检测细胞增殖能力。
　　2.原代培养HPASMCs，体外构建合成出3条ROCK-1小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)，并筛选其中1条抑制HPASMCs中ROCK-1信使RNA(Messenger RNA,mRNA)表达效率最高(至少70%)的siRNA靶序列，体外构建合成出1条Survivin siRNA，同理抑制效率至少70%，利用脂质体2000转染细胞，随后将细胞分为6组，即常氧空白对照组、常氧Survivin siRNA组、常氧ROCK-1 siRNA组、低氧空白对照组、低氧Survivin siRNA组、低氧ROCK-1 siRNA组， 用realtime-PCR检测细胞内ROCK-1 mRNA及Survivin mRNA的表达水平,然后用western blotting检测ROCK-1及Survivin蛋白质的表达及变化，CCK8和EDU免疫荧光检测细胞增殖能力。
　　结果：
　　1.realtime-PCR方法检测mRNA水平。发现，低氧处理后ROCK-1mRNA表达明显增加(P<0.05)，且在低氧4h后表达至高峰(P<0.05)；同时应用western blot和免疫荧光检测蛋白表达水平，发现，低氧处理后ROCK-1蛋白表达明显增加(P<0.05)，且在低氧4h后达高峰，而CCK8检测在低氧24h、48h、72h后细胞增殖能力均显著增高(P<0.05)。
　　2.Survivin siRNA能下调HPASMCs ROCK-1的mRNA及蛋白表达水平，而ROCK-1 siRNA不能下调HPASMCs中Survivin的mRNA及蛋白表达水平。
　　结论：
　　1.低氧促进HPASMCs增殖。
　　2.低氧可导致HPASMCs中ROCK-1表达增加，提示ROCK-1信号可能参与HPASMCs的增殖。
　　3.Survivin siRNA能抑制ROCK-1在HPASMCs中的表达，反之不然，说明Survivin在HPASMCs增殖信号传导的通路中位于ROCK-1的上游，且Survivin、ROCK-1均促进HPASMCs增殖。

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目录

第1章 前 言

第2章 实验材料

2.1 实验标本

2.2 实验试剂

2.3 主要实验仪器

第3章 实验方法

3.1 原代培养HPASMCs

3.2 HPASMCs的染色、鉴定

3.3 实验分组

3.4 ROCK-1 siRNA及Survivin siRNA的序列设计和细胞转染

3.5 realtime-PCR

3.6 用Western-blot方法检测HPASMCs中ROCK-1、Survivin、β-actin蛋白的表达量

3.7 细胞增殖检测（CCK8检测）

3.8 免疫荧光

第4章 统计分析

第5章 实验结果

5.1 HPASMCs的鉴定

5.2 常氧及低氧状态下，HPASMCs中ROCK-1表达情况

5.3 ROCK-1与Survivin促进HPASMCs增值信号通路中的关系

第6章 讨 论

第7章 结 论

参考文献

文献综述:Livin凋亡抑制机制及在肺组织中表达的研究

附录

致谢