核因子Nrf2负向调节肺炎支原体LAMPs诱导人THP-1细胞产生炎症物质

摘要

[目的]脂质相关膜蛋白（lipid-associated membrane proteins，LAMPs）是肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）的主要致炎因子。实验通过研究核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor2，Nrf2）对Mp LAMPs诱导人单核系THP-1细胞产生炎症因子、炎症蛋白及炎症介质的影响，了解Nrf2对Mp LAMPs所致炎症反应的调节作用，为进一步研究 Mp的致病机制提供新的理论依据。
　　[方法]培养Mp，离心收集菌体沉淀并抽提LAMPs，用BCA法测定LAMPs浓度。构建慢病毒载体pLKO.1-Nrf2 shRNA，将其与辅助包装质粒（psPAX2，pMD2G）共同转染HEK293T细胞用以包装慢病毒，将收获的慢病毒感染体外培养的THP-1细胞，嘌呤霉素筛选阳性感染细胞后，western blot和qRT-PCR分别检测慢病毒感染后THP-1细胞Nrf2的蛋白和mRNA水平。用5μg/mL和10μg/mL Mp LAMPs分别刺激Nrf2 shRNA慢病毒感染的THP-1细胞和对照慢病毒感染细胞，并设立PBS刺激为阴性对照组，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用为阳性对照组。ELISA检测处理后各组THP-1细胞白细胞介素6（interleukine6，IL-6）、白细胞介素8（interleukine8，IL-8）与前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的表达，Griess法检测一氧化氮（nitric oxide，NO）的产生水平，western blot检测环氧合酶2（cyclooxygenase2，COX-2）及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达。7.5μg/mL Mp LAMPs分别刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）、血红素氧合酶-1（heme oxygenase，HO-1）特异性激动剂钴原卟啉（cobalt protoporphyrin，CoPP）或HO-1特异性抑制剂锌原卟啉（zinc protoporphyrin，ZnPP）预处理的THP-1细胞，Nrf2 shRNA慢病毒感染细胞，对照病毒慢感染细胞及PBS处理的THP-1细胞，运用荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（2',7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）检测ROS的产生水平。
　　[结果]（1）测序结果显示所构建的pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒正确。与对照慢病毒感染及 PBS处理的THP-1细胞相比，pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒感染细胞Nrf2 mRNA表达水平分别抑制了64.73％与62.98%，而 Nrf2的蛋白表达量分别抑制了44.43%与40.48%；Mp LAMPs处理后pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒感染细胞Nrf2 mRNA表达水平与蛋白表达量分别降低了66.12%与52.12%；（2）Mp LAMPs刺激显著增强了THP-1细胞中IL-6、IL-8、COX-2、iNOS、PGE2的表达水平与NO和ROS的产生水平。Mp LAMPs刺激Nrf2 shRNA慢病毒感染的THP-1细胞后，IL-6、IL-8与 PGE2的表达水平分别为150.09pg/mL，196.18pg/mL和123.88 pg/mL，较对照慢病毒感染的THP-1细胞分泌的IL-6、IL-8与PGE2（分别为75.03pg/mL，90.09 pg/mL与66.42pg/mL）显著增高（p<0.05）；Mp LAMPs刺激后，Nrf2基因沉默组THP-1细胞表达的COX-2、iNOS蛋白水平较对照组分别升高了20.37%与26.65%（p<0.05），Nrf2基因沉默组 THP-1细胞产生的NO与ROS分别较对照组增加了73.17%与19.57（p<0.05）；（3）与无处理细胞相比较，ROS清除剂NAC预处理THP-1细胞后Mp LAMPs刺激细胞产生的ROS水平降低了8.28%，而Mp LAMPs诱导细胞HO-1 mRNA的表达水平升高了12.76倍；与无处理细胞相比较，HO-1特异性激动剂CoPP处理组Mp LAMPs刺激细胞产生的ROS水平降低了7.64%，而 HO-1特异性抑制剂 ZnPP处理组 Mp LAMPs刺激细胞产生的ROS的水平升高了15.28%。
　　[结论]Nrf2能够负向调节Mp LAMPs诱导THP-1细胞表达IL-6、IL-8、COX-2、iNOS、PGE2与产生NO和ROS。

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主要缩略语英文索引

第1章 绪论

第2章 实验材料

2.1 主要实验仪器

2.2 支原体菌株

2.3 细胞株

2.4 质粒

2.5 实验主要试剂

2.6 主要抗体

2.7 培养基及溶液配制

2.8 其他

第3章 实验方法

3.1 细胞培养、传代、冻存与复苏

3.2 pLKO.1-Nrf2shRNA慢病毒载体的构建、包装与感染

3.3 Mp LAMPs的抽提，内毒素及浓度测定

3.4 ELISA检测IL-6、IL-8、PGE2的表达水平

3.5 Griess法检测NO的产生

3.6 Western Blot检测Nrf2、iNOS与COX2蛋白的表达

3.7 Nrf2对Mp LAMPs诱导THP-1细胞产生ROS影响的检测

3.8qRT-PCR检测Nrf2 mRNA与HO-1 mRNA的表达水平

3.9 统计学分析

第4章 实验结果

4.1构建pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒载体

4.2检测Nrf2 shRNA慢病毒感染对THP-1细胞Nrf2的干扰效果

4.3 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1细胞表达IL-6、IL-8

4.4 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1细胞表达COX-2

4.5 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1细胞表达iNOS

4.6 Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1细胞表达PGE2

4.7Nrf2负向调节Mp LAMPs诱导THP-1细胞产生NO

4.8 Nrf2负向调节Mp LAMPs刺激THP-1细胞产生ROS

4.9 NAC与HO-1抑制Mp LAMPs刺激THP-1细胞产生ROS

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

综述:Nrf2/ARE通路在抗病原生物感染中的作用研究进展

攻读硕士学位期间主要研究成果

资助本论文的科研项目

致谢