碱蓬液泡型Na/H逆向运输蛋白基因的克隆及其向苜蓿中的转化

摘要

盐碱土是地球上广泛分布的一种土壤类型，然而由于灌溉方式不当，盐碱地面积不断增加，造成大面积土地被迫撂荒和植被的第一性生产力下降，限制了农业的发展，加剧了生态环境的恶化。在治理盐碱地的各项技术措施中，生物措施被认为是最有效的改良途径。即通过DNA重组技术，分离并转移植物耐盐基因，使其能在转基因植物中顺利表达，以提高转基因植物的耐盐性，培养优良抗盐品种，来开发利用盐碱地。液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白基因是渗透胁迫调节基因之一，编码负责Na<'+>/H<'+>交换的一种跨膜运输蛋白基因。Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白，不仅能保持植物细胞内低Na<'+>水平，而且在细胞器的发生及离子平衡过程中还具有渗透调节功能，是保持细胞pH和离子平衡的关键因子。本论文以生长在吉林省白城地区的碱蓬(Suaeda corniculata)为植物材料，首次分离并克隆了液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白基因全长cDNA片段(基因银行注册号码为DQ512716)，并且进行了序列分析；同时利用该基因构建植物表达载体，通过根癌农杆菌介导的方法将该基因转入苜蓿中。其主要研究结果如下： 1．实验通过RT-PCR与3’ RACE和5’ RACE的方法，从碱蓬中克隆到一个液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白基因(ScNHX1)，并进行了测序，基因全长为1665bp，推测的编码蛋白序列包含554个氨基酸残基，将此基因提交到GenBank，登录号是DQ512716。 2．利用分子生物学软件，对克隆得到的碱蓬Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白基因的核苷酸序列以及由此推导出的氨基酸序列进行了各种统计、结构分析和序列比较，得出以下结论： (1) 碱蓬Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白基因编码的Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白，pI为7.47，预测分子量为61.2KD。 (2) 碱蓬Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白与其它植物的液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白在核苷酸和氨基酸水平上有很高同源性；而与质膜型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白的同源性较低。初步证明：我们分离的碱蓬Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白是液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白。 (3) 碱蓬液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白的氨基酸序列分析表明，ScNHX1氨基端有12个序列保守的跨膜结构域(TM)，羧基端有亲水尾部。在TM3中有一段十几个氨基酸组成的保守区(<'85>LFFIYLLPPI<'94>)是氨氯吡嗪咪的结合域。TM5和TM6并没有完全跨过液泡膜具报道这两个跨膜结构域与Na<'+>结合，是液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白活性的重要结构域。 (4) 碱蓬液泡膜Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白序列中含有Asn的糖基化位点，证明该蛋白是已糖基化的蛋白。 (5) 碱蓬液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白序列含有Asp位点，在141位。 3．将碱蓬液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运输蛋白基因克隆到表达载体中，通过根癌农杆菌介导法，完成了ScNHX1基因向苜蓿中的转化。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1盐胁迫作用对植物的伤害机理

1.2植物的盐胁迫适应机理

1.3 Na+/H+逆向运输蛋白的研究现状

1.4本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1碱蓬液泡型Na+/H+逆向运输蛋白基因(SCNHX1)的分离

3.2 SCNHX1基因编码的氨基酸序列特征分析

3.3 SCNHX1基因向苜蓿中的转化

4讨论

4.1 RNA的提取与聚合酶链式反应

4.2 SCNHX1基因编码一种液泡型Na+/H+逆向运输蛋白

4.3根癌农杆菌介导的SCNHX1基因向苜蓿中的转化

5结论

参考文献

附录

致谢