PCSK9/IDOL在姜黄素烟酸酯促进肝细胞摄取LDL的作用及机制

摘要

血浆LDL-C水平升高是动脉粥样硬化性心血管疾病最重要的危险因素，国内外血脂异常防治协会均指出以降低血浆LDL-C为首要目标，且目标值越低越好。他汀类作为降低LDL-C的首选药物，在临床中具有显著降低LDL-C，减少ASCVD患病风险的作用，然而不良反应也显现出来，在高危人群和易感人群易诱发肌痛、横纹肌溶解症及糖尿病等，已有文献在Nature、BMJ杂志报道。他汀类的主要机理是通过竞争性抑制胆固醇合成的限速酶(HMGCR)降低LDL-C，也有文献报道他汀类还增高了LDLR蛋白表达。血浆中绝大多数的LDL-C经LDLR内吞循环代谢。LDLR功能障碍及内吞循环量的减少均导致了血浆LDL-C的清除减弱，而LDLR功能缺失极易引起家族性高胆固醇血症，使ASCVD患病风险增高。为此研究LDLR在LDL-C的清除作用仍然必要。
　　LDLR主要受转录水平及转录后水平的调节。在转录水平主要受胆固醇调节原件结合蛋白(SREBP2)的调节，靶基因除了LDLR外，还有HMGCR、PCSK9及鲨烯单加氧酶等。抑制HMGCR的药物他汀类已广泛应用于临床。LDLR还受PCSK9及IDOL转录后水平的调节。PCSK9和LDLR虽然同受SREBP2转录水平的调节，但PCSK9前体还具有协助LDLR成熟的作用，而成熟的PCSK9则调节LDLR内吞经溶酶体降解，为此，科学界研究学者曾对PCSK9结构和功能的研究达到白炙化。现针对抑制PCSK9功能的药物是PCSK9的单克隆抗体，已被美国FDA批准用于不耐受他汀类且家族性高胆固醇血症患者的治疗。IDOL则是2009年才首次被研究确定具有诱导LDLR泛素化经溶酶体降解的作用，为此IDOL的中文名称为诱导LDLR降解蛋白。关于IDOL具有降解LDLR降解作用的文献报道后，脂质研究学者开始关于IDOL在人群多态性影响LDL-C代谢的研究，已经明确IDOL功能缺失与As成反比，反之IDOL功能性获得则促进了LDL-C升高，加速了As进程。为此，科学界提出抑制IDOL同样可作为临床降血脂药物开发靶点的假说。
　　姜黄素烟酸酯(CurTn)是将姜黄素两个羟基引入烟酸羧基形成具有多个功能基团的酯类衍生物，其姜黄素与烟酸均具有降低血浆LDL-C的作用，为此，我们前期研究结果显示CurTn可显著降低As模型小鼠LDL-C的作用，但机制不明。因LDL-C主要经LDLR内吞循环代谢，我们进一步检测了LDLR的表达水平，结果显示LDLR的mRNA水平无显著变化，而LDLR蛋白表达却显著增高。我们推测出CurTn可能通过转录后水平调节LDLR蛋白表达。为此提出了CurTn调节PCSK9/IDOL促进肝细胞摄取LDL的研究设想。为回答这一科学问题，在第一部分的研究中进一步筛选了与LDL-C代谢有关基因的表达，并检测了细胞内胆固醇含量的变化，研究CurTn作用于LDLR蛋白表达的相关性。那么这一LDLR表达增高是否与增高了细胞膜LDLR内吞循环量有关，在第二部分通过DiI-LDL摄取实验及免疫荧光检测细胞膜LDLR水平，研究CurTn对胆固醇摄取、LDLR内吞循环量、PCSK9及IDOL蛋白表达的影响。为了回答这一影响的特异性，在第三部分通过过表达及干扰PCSK9和IDOL的慢病毒载体感染HepG2细胞，研究CurTn引起的降低血浆LDL-C与PCSK9\IDOL特异性表达变化的影响，探讨CurTn促进肝细胞摄取LDL-C的作用靶点，为临床调脂药物开发提供理论依据。
　　第一部分、CurTn对HepG2细胞LDL-C摄取的影响
　　目的：明确CurTn降低血浆LDL-C的机制涉及到摄取LDL-C的增多，LDLR蛋白表达增高。
　　方法：HepG2细胞在5％ CO2、37℃条件下用含有10%FBS和1%Penicillin-streptomycin的 DMEM培养液贴壁24h后，实验分组：1: Basal;2:Control(25mg/L LDL);3:CurTn5μM(25mg/L LDL+CurTn5μM);4:CurTn10μM(25mg/L LDL+CurTn10μM);5:CurTn15μM(25mg/L LDL+CurTn15μM);6:EZE30μM(25mg/L LDL+Ezetimibe30μM)。CurTn与LDL共孵育体外培养HepG2细胞，油红O、荧光酶法检测细胞内胆固醇的含量，RT-Q-PCR及Western Blotting检测胆固醇代谢有关的基因INSIG1、SREBP2、LDLR、HMGCR、PCSK9的mRNA及蛋白表达。
　　结果：与Control组比较，CurTn处理后油红O染色显示细胞内小红色脂滴增多，荧光酶法结果显示胆固醇含量显著增多。那么，这种增多是胆固醇摄取增多还是合成增多，进一步通过RT-Q-PCR及Western Blotting结果显示5、10μM CurTn对HMGCR的mRNA及蛋白表达无影响，仅在15μM CurTn组有升高的趋势，表明CurTn对胆固醇合成无显著影响；对SREBP2的mRNA及蛋白表达、LDLR mRNA表达无显著差异，表明不是在转录水平调节LDLR表达；CurTn促进LDLR蛋白表达增多及PCSK9蛋白表达的减少，提示CurTn可能转录后水平调节LDLR蛋白表达。
　　小结：CurTn使肝细胞胆固醇含量增多、LDLR蛋白表达增高，可能与PCSK9蛋白表达减少有关。
　　第二部分、CurTn促进HepG2细胞摄取LDL-C与PCSK9/IDOL调节细胞表面LDLR分布的相关性研究
　　目的：明确CurTn降低血浆LDL-C的机制是细胞摄取LDL-C增多，LDLR蛋白表达增高与降低PCSK9及IDOL蛋白表达有关。
　　方法：按第一部分实验分组，CurTn与DiI-LDL共孵育体外培养HepG2细胞，检测CurTn对肝细胞摄取胆固醇能力的影响；免疫荧光流式细胞仪检测CurTn对细胞膜LDLR分布丰度的影响；Western Blotting检测转录后调节LDLR有关的基因IDOL、K48、K63及USP2的蛋白表达，免疫共沉淀检测LDLR及IDOL泛素化水平，探究CurTn转录后调节LDLR表达可能的机制。
　　结果：与Control组比较，CurTn处理组橙红色荧光显著增强，表明胆固醇摄取增多；免疫荧光流式结果显示CurTn处理组细胞膜LDLR水平增多，表明CurTn通过细胞膜LDLR分布丰度的增多促进LDL的摄取；Western Blotting结果显示CurTn5、10、15μM处理后IDOL蛋白表达显著降低；免疫共沉淀结果显示CurTn5、10、15μM处理后LDLR泛素化程度显著降低，表明CurTn通过降低IDOL引起了LDLR泛素化程度的降低；而CurTn处理组IDOL泛素化程度升高，表明CurTn促进了IDOL泛素化，可能加速了泛素化的IDOL经蛋白酶体途径降解使IDOL蛋白含量减少。随后进一步通过Western Blotting检测发现CurTn处理组显著降低USP2的表达，而在CurTn10、15μM高浓度组引起K48和K63表达显著降低，结果表明CurTn引起LDLR去泛素化程度降低，USP2作用随之减少，提示LDLR在溶酶体降解显著减少。
　　小结：CurTn使肝细胞胆固醇摄取增多、细胞膜LDLR水平增高，可能与IDOL、PCSK9蛋白表达减少有关。
　　第三部分、CurTn通过抑制PCSK9/IDOL的蛋白表达使HepG2的LDLR蛋白水平升高
　　目的：阐明CurTn特异性降低PCSK9及IDOL蛋白表达引起LDLR蛋白表达增高，促进肝细胞摄取LDL的作用机制。
　　方法：构建过表达IDOL及PCSK9慢病毒及各三种干扰IDOL及PCSK9的慢病毒，感染 HepG2细胞，形成稳转细胞系，荧光显微镜检测感染效率，RT-Q-PCR及Western Blotting检测IDOL及PCSK9表达水平，鉴定稳转效果；CurTn15μM作用前后对IDOL、PCSK9及慢病毒干扰/过表达IDOL感染HepG2细胞后LDLR蛋白表达水平。
　　结果：筛选出RNAi-IDOL及RNAi-PCSK9有效抑制表达序列的慢病毒载体用于后续实验。RT-Q-PCR及Western Blotting结果显示RNAi-IDOL及RNAi-PCSK9显著抑制相应的IDOL及PCSK9的mRNA及蛋白表达，而LV-IDOL及LV-PCSK9则相应显著增高IDOL及PCSK9的mRNA及蛋白表达。感染HepG2细胞，选择的条件为5μg/mL Polybrene及10%FBS DMEM，过表达慢病毒感染MOI为10，干扰MOI则为30，判断的条件是细胞形态良好，感染率达到80%以上。嘌呤霉素2μg/mL筛选稳转慢病毒细胞。CurTn15μM作用24h后，维持干扰RNAi-IDOL及RNAi-PCSK9引起的IDOL及PCSK9蛋白表达降低的现象；并在慢病毒干扰IDOL后用CurTn作用24h可使LDLR蛋白水平升高；CurTn还能逆转过表达LV-PCSK9及LV-IDOL引起的PCSK9/IDOL过表达效应；并且升高了LV-IDOL组LDLR蛋白水平。
　　小结：CurTn通过特异性IDOL、PCSK9蛋白表达减少使肝细胞胆固醇摄取增多、细胞膜LDLR水平增高，促进肝细胞摄取LDL。

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主要缩略语中英文索引

第一部分 CurTn对HepG2细胞LDL-C摄取的影响

1.前言

2.实验材料

3.实验方法：

4.实验结果

5.讨论

6.小结

第二部分 CurTn促进HepG2细胞摄取LDL-C与PCSK9/IDOL调节细胞表面LDLR分布的相关性研究

1.前言

2.实验材料

3.实验方法

4.实验结果

5.讨论

6.小结

第三部分CurTn通过抑制PCSK9/IDOL的蛋白表达使HepG2的LDLR蛋白水平升高

1.前言

2.实验材料

3.实验方法

4.实验结果

5.讨论

6.小结

结论

参考文献

综述 :血脂异常治疗新靶点IDOL—诱导LDLR降解蛋白

攻读学位期间所获科研成果

致谢

课题资助