二氢杨梅素对人白血病Jurkat细胞增殖与凋亡的影响及机制

摘要

目的:探讨二氢杨梅素（dihydromyricetin,DMY）对人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖及凋亡的影响，并从mTOR/自噬途径的角度探讨其可能的作用机制。
　　方法:体外培养人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞，用含不同浓度（20、40、60、80和100mg/L）的DMY和5％胎牛血清的RPMI1640完全培养液培养Jurkat细胞12、24和48小时。用60mg/L的DMY和10mmol/L细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）共同处理Jurkat细24小时。四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法用来检测细胞活力并计算细胞增殖抑制率，流式细胞术用来检测细胞凋亡并计算细胞凋亡率，采用透射电镜观察Jurkat细胞自噬体形成等超微结构。采用Western Blot检测Jurkat细胞中自噬相关基因Beclin1、LC3和p62的表达。采用实时定量PCR和Western Blot检测Jurkat细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammaliantarget of rapamycin,mTOR）mRNA的表达。
　　结果：
　　1.DMY显著抑制了Jurkat细胞的增殖(P﹤0.05)，呈现剂量和时间依赖性，在12、24和48小时时间点的药物半数抑制浓度(50% inhibition concentration,IC50)逐渐降低，IC50分别为217、155和92mg/L，最佳作用浓度和时间是60mg/L处理24小时。
　　2.DMY能以剂量和时间依赖的方式诱导Jurkat细胞的凋亡(P﹤0.05)，最佳作用浓度和时间是60mg/L处理24小时。
　　3.对照组Jurkat细胞的细胞形态正常，呈不规则形，细胞核呈圆形或椭圆形，核膜和核仁清晰可见，核染色质均匀分布，细胞质中可发现大量的线粒体、内质网和核糖体等细胞器，可见少量自噬泡或自噬体。DMY(60mg/L)处理24小时组Jurkat细胞多呈不规则形，细胞核稀疏成网状，细胞核内可发现部分染色质固缩，部分线粒体出现空泡化，其他细胞器部分肿胀，少部分细胞膜出现破裂，细胞肿胀明显，细胞质中可发现双层膜结构的自噬小体和单层膜的自噬溶酶体，其中包含有处在不同降解阶段的胞浆成分或细胞器；与对照组比较，DMY(60mg/L)处理24小时组细胞中双层膜结构的自噬小体和单层膜的自噬溶酶体的数量及自噬泡占胞质总面积的百分率显著性增加(P﹤0.05)。
　　4.与对照组比较，DMY(60mg/L)处理24小时组Jurkat细胞中自噬相关基因Beclin1和LC3-Ⅱ的表达显著上调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值显著增加，而p62的表达显著降低(P﹤0.05)。
　　5.与对照组比较，DMY(60mg/L)处理24小时组Jurkat细胞中mTOR mRNA和蛋白的表达均显著降低(P﹤0.05)。
　　6.自噬抑制剂3-MA部分取消了DMY抑制Jurkat细胞增殖和诱导Jurkat细胞凋亡的作用(P﹤0.05)。
　　结论:二氢杨梅素可抑制Jurkat细胞的增殖，并诱导其凋亡，其机制可能与DMY下调mTOR的表达，诱导细胞自噬有关。

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中英文缩略词

第1章 绪论

第2章 材料与方法

2.1 试剂和仪器

2.2 实验中主要溶液的配制

2.3 实验方法

第3章 结果

3.1二氢杨梅素抑制急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞的增殖

3.2二氢杨梅素对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的影响

3.3 二氢杨梅素对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞超微结构的影响

3.4二氢杨梅素对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞Beclin 1表达的影响

3.5 二氢杨梅素对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞LC3表达的影响

3.6 二氢杨梅素对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞p62表达的影响

3.7 二氢杨梅素对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞中mTOR表达的影响

3.8 自噬抑制剂3-MA对二氢杨梅素抑制Jurkat细胞增殖的影响

3.9 自噬抑制剂3-MA对二氢杨梅素诱导Jurkat细胞调亡的影响

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

综述:二氢杨梅素抗肿瘤效应的研究进展

硕士期间发表的论文

致谢