IL-6过表达对大肠癌细胞株凋亡的影响及其对5-FU敏感性的研究

摘要

目的：白介素6（IL-6）在大肠癌的发生、发展中产生了重要作用。因此，本实验通过电转染白介素6基因来使大肠癌Lovo细胞中的白介素6过表达，探讨白介素6对大肠癌Lovo细胞增殖与凋亡的影响，用MTT法检测白介素6基因过表达Lovo细胞株对5氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性。
　　方法：实验分为3组：正常 Lovo细胞组、空载质粒 Lovo细胞组、过表达质粒Lovo细胞组。1）建立白介素6基因过表达Lovo细胞株：通过采用分子克隆技术将白介素6基因插入表达载体 pECFP-N1的克隆位点之间，获得重组质粒 IL-6-pECFP-N1，通过 DNA测序鉴定阳性质粒，以电穿孔转染法将重组质粒 IL-6-pECFP-N1导入受体Lovo细胞中，获取白介素6基因过表达Lovo细胞株。2）用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测白介素6蛋白的含量来判断三组细胞白介素6的表达情况。3）转导 Lovo细胞株细胞凋亡检测：用7-AAD/PE-Annexin V染色法流式细胞术检测12h、36h、72h三个时间点各细胞株的凋亡或存活情况。4）MTT检测不同浓度（20ug/ml、80ug/ml、160ug/ml、320ug/ml）的5-氟尿嘧啶处理各组细胞株后12h、36h、72h三个时间点的细胞增殖抑制情况。
　　结果：
　　1）测序结果显示成功构建了重组质粒 IL-6-pECFP-N1。
　　2）酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测白介素6蛋白的含量：白介素6蛋白在三组细胞中都有不同水平的表达，在白介素6基因过表达 Lovo细胞株中表达水平最高，且含量明显高于正常 Lovo细胞组、空载质粒 Lovo细胞组，而正常 Lovo细胞组与空载质粒 Lovo细胞组白介素6的含量差别无统计学意义。
　　3）7-AAD/PE-Annexin V染色法流式细胞术检测结果表明白介素6基因过表达 Lovo细胞组细胞存活量明显高于正常 Lovo细胞组细胞存活量与空载质粒Lovo细胞组细胞存活量，差异有统计学意义。而正常Lovo细胞组细胞存活量与空载质粒Lovo细胞组细胞存活量差异无统计学意义。
　　4）MTT检测结果显示5-氟尿嘧啶对各组细胞增殖均有抑制作用，抑制率呈时间-浓度依赖性。而三组间白介素6过表达Lovo细胞组的增殖抑制率明显高于正常 Lovo细胞组与空载质粒 Lovo细胞组，差异具有统计学意义，正常 Lovo细胞组与空载质粒 Lovo细胞组的增殖抑制率无明显差异。
　　结论：
　　1）成功构建了重组质粒 IL-6-pECFP-N1，通过电转染重组质粒成功获得了白介素6基因过表达 Lovo细胞株。
　　2）大肠癌Lovo细胞转染白介素6基因后，能够使白介素6获得相对高表达。
　　3）白介素6基因过表达大肠癌 Lovo细胞株体外培养其凋亡率明显受到抑制，结果显示，白介素6对大肠癌Lovo细胞的凋亡具有抑制作用。
　　4）白介素6基因过表达大肠癌Lovo细胞株对5-氟尿嘧啶敏感，且随时间及浓度的增加，增殖受到明显抑制。

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主要英文缩略语索引

前言

第一章白介素6基因对大肠癌Lovo细胞凋亡的影响

一 大肠癌细胞Lovo细胞系的培养

1 实验材料

2 实验方法

二 IL-6-pECFP-N1质粒的构建

1.实验材料

2. IL-6-pECFP-N1过表达质粒的构建

三 大肠癌Lovo细胞电穿孔法转染IL-6质粒

1.1 主要仪器

2 实验分组

3 电转染实验步骤

四．ELISA检测Lovo细胞转染IL-6质粒后IL-6的表达

1.主要仪器

2.主要试剂

3.主要试剂配制

4.样本处理及要求

5.实验操作步骤

6.计算方法

7.实验结果

五．7-AAD/PE流式细胞术检测IL-6基因过表达对细胞凋亡的影响

1.主要仪器

2.主要试剂

3.主要液体配制

4.实验分组

5.流式检测细胞凋亡实验方法

6.实验结果

第二章 过表达白介素6的大肠癌Lovo细胞对5氟尿嘧啶的敏感性研究

MTT检测不同浓度5-氟尿嘧啶处理IL-6转染组细胞增殖情况

1.主要仪器

2.主要试剂

3.主要试剂配制

4.实验分组

5.实验方法

统计学分析

实验结果

第三章讨 论

第四章结 论

参考文献

综述:大肠癌细胞白介素6的表达与5-氟尿嘧啶敏感性的相关研究

研究生在读期间发表的论文

致谢