Notch1通路介导染料木素拮抗对氧磷诱导的HUVECs氧化应激损伤

摘要

目的：
　　1.通过建立对氧磷(PO)诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化应激损伤模型，初步探讨 Notch1信号通路在 PO引起氧化应激损伤中的作用。
　　2.探讨植物雌激素染料木素(Gen)对PO引起的HUVECs氧化应激损伤的保护作用与Notch1信号通路之间的关系。
　　方法：
　　1.PO氧化应激损伤模型建立：以不同浓度（0，300，600，900，1200，2400μM)的PO和溶媒0.1％DMSO处理HUVECs24h，用试剂盒分别测定各组细胞活力(OD值)、乳酸脱氢酶（LDH）释放量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量；Western blot法检测各组细胞中Notch1、Hes1、Bax、Caspase3和Bcl-2蛋白表达水平。观察PO对HUVECs的氧化损伤效应的量效关系。选择上述实验中获得的最佳PO刺激终浓度(1200μM)处理HUVECs不同时间（0，6，12，24h)，同上检测各生化指标和蛋白表达。观察PO对HUVECs的氧化应激损伤的时效关系。
　　2.Gen保护HUVECs氧化应激损伤的量效、时效关系观察：以不同浓度的Gen(0，0.05，0.1，0.5，1μM)与HUVECs共同孵育10h，再以PO（1200μM） 处理HUVECs24h。检测各项生化指标和蛋白表达，观察Gen保护HUVECs免受氧化应激损伤的量效关系。再以最佳浓度Gen(0.5μM)预处理HUVECs不同时间(0，6，10，14h)后，观察Gen保护HUVECs受氧化应激损伤的时效关系。
　　3.Gen抗PO氧化应激损伤作用与Notch1信号通路的关系初探：培养的HUVECs分为空白对照、PO刺激、PO+DAPT、DAPT处理、Gen+PO+DAPT和PO+Gen六组。以Gen(0.5μM)预处理HUVECs10h后，加Notch1特异性阻断剂DAPT(10μM)和/或PO（1200μM）再共同培养24h后分别测定细胞活力、LDH、SOD和MDA含量，再次检测各蛋白的表达水平。
　　结果：
　　1.不同浓度PO处理HUVECs24h后，在显微镜下观察300、600μM的PO刺激HUVECs24h后，细胞形态等均无明显改变，1200、2400μM的PO刺激可引起细胞内空泡与碎片增多，细胞间排列稀疏；空白组与DMSO组细胞状态良好。CCK8分析结果显示与空白对照组相比，不同浓度的PO（900，1200，2400μM）作用于HUVECs可剂量依赖性地导致细胞活力降低(P<0.01)。溶媒对照（0.1%DMSO）与空白组相比细胞活力下降不明显（P>0.05）。培养液中相关生化指标测定结果显示，与空白对照组相比，PO(600、900、1200、2400μM）刺激可导致细胞培养液LDH和MDA含量显著升高，SOD含量显著降低（P＜0.01）。Western-blot结果显示，与空白对照组相比，1200μM的PO可显著上调Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表达（P<0.05)，同时下调Bcl-2的表达和降低Bcl-2/Bax比值（P<0.05）。
　　2.采用1200μM PO刺激HUVECs不同时间（0，6，12，24h），可呈时间依赖性地降低细胞活力（P<0.05)，升高LDH和MDA含量，SOD含量显著降低（P<0.05）。PO刺激24h可显著上调Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表达（P<0.05)，下调Bcl-2的表达，降低Bcl-2/Bax比值（P<0.05)。
　　3.用Gen(0.5，1μM)预处理的细胞存活率显著升高，培养液中LDH和MDA含量显著降低，SOD活性显著升高，且在0.5μM浓度处理条件下效果最明显（P<0.05）。与PO组相比，Gen（0.5μM）可显著下调Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表达（P<0.05），上调 Bcl-2表达和增加Bcl-2/Bax比值（P<0.05）。
　　4.用Gen（0.5μM）预处理HUVECs不同时间，随着保护时间的延长细胞活力显著上升（P<0.01)，培养液中LDH和MDA含量显著下降，SOD含量显著升高（P<0.05）。Gen预处理10，14h后可显著下调Notch1、Hes1、Caspase3、Bax的表达（P<0.05)，上调Bcl-2的表达，增加Bcl-2/Bax比值（P<0.05)，具有时间依赖性。
　　5.用Notch1通路的特异性阻断剂DAPT(10μM)处理细胞后，与PO+Gen组相比，显微镜下可见P+D+G组细胞受损明显，细胞脱落较多，细胞间隔增大。CCK8分析结果表明，与空白组相比，DAPT组细胞活力无明显变化(P>0.05)。加了PO的各组细胞活力显著下降(P<0.05)。与PO+Gen组相比，PO+DAPT+Gen组细胞活力同样下降（P<0.05)。酶学测定显示，与空白对照组相比，加了PO的各组细胞培养液中LDH和MDA含量显著上升，SOD含量显著下降(P<0.05）。与Gen+PO组相比， Gen+PO+DAPT组细胞LDH和 MDA含量显著上升，SOD含量显著下降(P<0.05)。Western-blot结果显示，与空白组相比，PO（1200μM）刺激24h可显著上调Notch1、Hes1、Caspase3、Bax的表达（P<0.05)，下调Bcl-2的表达，降低Bcl-2/Bax比值（P<0.05)，而DAPT组上述蛋白表达变化没有统计学意义。与Gen+PO组相比，PO+DAPT+Gen组可显著上调Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表达（P<0.05)，下调Bcl-2表达，降低Bcl-2/Bax比值（P<0.05)，提示Gen拮抗HUVECs氧化应激损伤很可能是通过调控Notch1信号通路来实现。
　　结论：
　　1.PO呈浓度与时间依赖性地损伤HUVECs，Gen对PO刺激导致的HUVECs氧化应激损伤具有保护作用。
　　2.对氧磷可上调Notch1、Hes1、Caspase3、Bax蛋白，下调Bcl-2蛋白表达，降低Bcl-2/Bax比值损伤血管内皮细胞，Gen通过调节上述蛋白表达保护HUVECs免受PO刺激引起的氧化应激损伤。

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主要英文缩略词

第1章 前言

第2章 实验材料

2.1 细胞株

2.2 主要药品与试剂

2.3 主要仪器

2.4 试剂配制

第3章 实验方法

3.1 HUVECs的传代培养、冻存与复苏

3.2 实验分组及药物处理

3.3 CCK8法检测细胞活力

3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

3.5 丙二醛（MDA）含量测定

3.6 乳酸脱氢酶 (LDH) 含量测定

3.7Western blot检测相关蛋白表达

3.8 数据分析

第4章 实验结果

4.1 PO对HUVECs氧化应激损伤作用观察

4.2 Gen干预PO刺激HUVECs致氧化应激损伤的量效、时效关系

4.3 Gen抗PO刺激HUVECs与Notch1信号通路的关系

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

文献综述: 染料木素心血管保护作用及机制研究

附录

致谢