IL-10通过JAK2/STAT3信号通路拮抗低氧诱导的神经干细胞凋亡

摘要

目的：利用三气培养箱构建神经干细胞低氧损伤模型，观察白细胞介素-10（IL-10）是否对低氧状态下神经干细胞的损伤产生保护作用，探讨IL-10是否通过激活JAK2/STAT3信号通路拮抗低氧诱导神经干细胞凋亡。
　　方法：采用小鼠C17.2神经干细胞系作为研究对象，利用三气培养箱模拟低氧环境，建立NSCs低氧损伤模型。第一阶段：实验分为正常对照组和低氧干预组，分别于低氧0h、24h、48h、72h时间点运用噻唑蓝（MTT）比色法观察低氧对NSCs的损伤，同时摸索低氧对NSCs影响的适宜时间；于低氧0h、24h、48h时间点用吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）荧光双染法观察低氧状态下细胞凋亡及形态学变；用Western Blot检测HIF-1α蛋白的表达；第二阶段：实验分为低氧培养组、低氧+IL-10干预组，分别于低氧0h、24h、48h时间点用MTT比色法检测NSCs的存活率。第三阶段：将实验分为正常对照组、低氧对照组、低氧+IL-10干预组、低氧+IL-10+AG-490(JAK2/STAT3通路阻断剂)组、低氧+AG-490组，利用Western Blot检测各组细胞p-STAT3、Bcl-XL、Bcl-2蛋白的表达。
　　结果：1、第一阶段NSCs的存活率：24h、48h、72h低氧培养组与正常培养组相比较，细胞的存活率均下降（P<0.05）；NSCs凋亡及形态学变化：显微镜观察低氧培养组神经干细胞数量较正常对照组明显减少，可见早期凋亡细胞。HIF-1α蛋白的表达：与正常对照组相比，低氧培养24h的HIF-1α蛋白表达量增高（P<0.05）;低氧培养48h的HIF-1α蛋白表达量明显增高（P<0.05）。结合实验结果,为了排除时间对细胞自身增殖的误差，及72小时低氧培养细胞存活率低影响实验结果，本实验采取48h低氧培养模拟神经干细胞低氧损伤模型。
　　2.第二阶段NSCs的存活率:低氧+IL-10干预组与低氧对照组相比较，在低氧培养24h、48h时间点的细胞存活率均明显升高（P<0.05）；而在低氧培养0h时间点的细胞存活率无明显变化（P>0.05）。
　　3、第三阶段各组细胞p-STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白的表达:
　　p-STAT3蛋白：低氧+IL-10组较低氧对照组蛋白表达升高（P<0.05），低氧对照组较正常对照组蛋白表达减少（P<0.05）。
　　Bcl-2蛋白：与低氧对照组相比，低氧+IL-10组的Bcl-2蛋白表达量增多（P<0.05）；正常对照组的Bcl-2蛋白表达量同样增多（P<0.05）。
　　Bcl-XL蛋白：与低氧对照组相比，低氧+IL-10干预组的Bcl-XL表达量升高（P<0.05）；正常对照组的Bcl-XL表达量同样升高（P<0.05）。
　　结论：IL-10可拮抗低氧诱导的神经干细胞凋亡，其机制可能是通过激活JAK2/STAT3信号通路，上调Bcl-2、Bcl-XL蛋白，从而发挥抗凋亡作用。

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目录

第1章 绪 论

第 2 章 实 验 材 料

2.1 实验场地及细胞

2.2 主要仪器及试剂

第 3 章 实 验 方 法

3.1 NSCs的培养、传代

3.2 实验分组

3.3 MTT 比色法检测NSCs活力

3.4 荧光显微镜观察各组细胞凋亡情况

3.5Western Blot检测各组HIF-1α、Bcl-2、Bcl-XL、p-STAT3蛋白的表达

3.6 统计学处理

第 4 章 实 验 结 果

4.1 神经干细胞的形态学

4.2 不同低氧培养时间对神经干细胞数目形态的影响

4.3 AO/EB双染法评估低氧培养对神经干细胞凋亡的影响

4.4 MTT评估NSCs低氧损伤模型的建立

4.5. 三气培养箱低氧培养神经干细胞能诱导HIF-1α蛋白表达的升高

4.6 IL-10对低氧培养神经干细胞具有保护作用

4.7 低氧环境IL-10干预对p-STAT3蛋白表达的影响

4.8 低氧环境下IL-10干预对Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达的影响

第 5 章 讨 论

5.1 三气培养箱构建神经干细胞体外低氧模型

5.2 IL-10对低氧条件下神经干细胞的影响

5.3 IL-10对低氧条件下NSCs的保护作用及机制的研究

第 6 章 结 论

参考文献

综述:IL-10在神经系统疾病中的研究进展

作者攻读学位期间发表的论文

致谢