枸杞多糖对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用及机制研究

摘要

目的：采用高糖高胰岛素诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型，通过观察不同浓度的枸杞多糖（lyceum barbarum polysaccharide，LBP）对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响，探讨其改善胰岛素抵抗可能的分子机制，为进一步认识、利用枸杞多糖提供理论依据，也为将来枸杞多糖治疗2型糖尿病提供科学依据，具有重要意义。
　　方法：采用高糖高胰岛素处理HepG2细胞24小时建立胰岛素抵抗细胞模型，通过葡萄糖消耗实验判断模型是否建立、噻唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度的LBP对HepG2细胞活性的影响，选择三个合适的浓度、确定药物作用时间用于后续实验。用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测不同浓度LBP对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。比色法测定细胞内氧化应激指标丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量；Westen-Blot法测定胰岛素信号转导通路中相关蛋白（IRS-2、PI3K、Akt、GLUT2）的表达水平。
　　结果：1.枸杞多糖对HepG2细胞活性的影响：LBP处理HepG2细胞24h和48h后，低浓度（100，300μg/ml）枸杞多糖不影响细胞活性；而高浓度（500、1000、3000、5000μg/ml）枸杞多糖呈浓度依赖性抑制HepG2细胞活性。当处理时间延长至72h时，高浓度的枸杞多糖对HepG2细胞活性的抑制作用愈加明显，且呈剂量依赖效应，与对照组（24h,0μg/ml）相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，为了排除枸杞多糖对细胞活力的影响，本实验选择30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml分别作为低浓度枸杞多糖组（L-LBP）、中浓度枸杞多糖组（M-LBP）和高浓度枸杞多糖（H-LBP组）的浓度值，处理细胞时间选择48h。
　　2.枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响：与正常对照组相比，IR模型组细胞葡萄糖消耗量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立成功。与IR模型组相比，高浓度和中浓度的LBP显著提高了胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量，差异有统计学意义（P＜0.05），而低浓度LBP对HepG2细胞的葡萄糖消耗量无显著影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。与罗格列酮组相比，高、低浓度LBP组葡萄糖消耗量显著降低（P＜0.05），中浓度LBP组葡萄糖消耗量无显著性差异（P＞0.05）。
　　3.枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞MDA含量和SOD活力的影响：与正常对照组相比，IR模型组细胞MDA含量显著升高，SOD活力显著降低（P＜0.05）。与IR模型组相比，高、中浓度LBP组细胞MDA含量显著降低（P＜0.05）；而低浓度LBP组差异无统计学意义（P＞0.05）；高浓度、中浓度和低浓度LBP组细胞SOD活力均显著升高（P＜0.05）。与罗格列酮组相比，中浓度LBP组MDA含量显著降低（P＜0.05）；高、中浓度LBP组SOD活力显著升高（P＜0.05）。
　　4.枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞IRS-2、PI3K、Akt、GLUT2蛋白表达的影响：与正常对照组相比，IR模型组IRS-2、PI3K、Akt、GLUT2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与IR模型组相比，高、中浓度LBP组IRS-2、PI3K、Akt、GLUT2蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而低浓度LBP组差异无统计学意义（P＞0.05）。与罗格列酮组相比，高、中、低浓度LBP组IRS-2、PI3K、Akt、GLUT2蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：枸杞多糖能改善HepG2细胞胰岛素抵抗，其作用机制可能与增强细胞抗氧化能力及提高胰岛素信号传导通路相关蛋白（IRS2、PI3K、Akt、GLUT2）的表达有关。

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主要缩略及英文索引

目录

第1章 绪 论

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验场地及细胞

2.1.2 实验主要仪器和设备

2.1.3 实验主要药品及试剂

2.1.4 主要实验试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 HepG2细胞的培养与传代

2.2.2 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立

2.2.3 MTT比色法

2.2.4 葡萄糖消耗实验

2.2.5 MDA含量的测定

2.2.6 SOD活力的测定

2.2.7 Western Blot检测各组IRS-2、PI3K、Akt、GLUT2蛋白的表达

2.2.8 统计学处理

第3章 结 果

3.1 枸杞多糖对HepG2细胞活性的影响

3.2 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

3.3 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞SOD活力的影响

3.4 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞MDA含量的影响

3.5 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞IRS-2、PI3K、Akt和GLUT2蛋白表达的影响

3.5.1 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞IRS-2蛋白表达的影响

3.5.2 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞PI3K蛋白表达的影响

3.5.3 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞Akt蛋白表达的影响

3.5.4 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞GLUT2蛋白表达的影响

第4章讨 论

4.1 IRS-PI3K-Akt信号通路在胰岛素抵抗的作用

4.2 氧化应激与胰岛素抵抗

第5章 结 论

参考文献

综述:枸杞多糖与糖尿病的研究进展

攻读硕士学位期间完成、发表论文情况

研究基金资助项目

致谢