LIMK-1基因沉默对罗格列酮抑制人胃癌 MGC803细胞裸鼠皮下移植瘤的影响

摘要

目的：课题组前期研究发现，LIMK1过表达可促进人胃癌MGC803细胞的增殖，但经罗格列酮处理后可抑制人胃癌 MGC803的增殖。为进一步探究LIMK1沉默基因对罗格列酮抑制人胃癌MGC803细胞皮下裸鼠移植瘤的影响。我们进行了如下的实验。
　　方法：将对数生长期的人胃癌 MGC803细胞消化成单细胞悬液，在48只BALB/C裸鼠右侧腋窝皮下注射200μl（约1×107个细胞）单细胞悬液，建立人胃癌MGC803细胞裸鼠移植瘤模型。待移植瘤最长径达6～8mm时，将裸鼠编号并随机分组，分为LIMK1-shRNA组、NC-shRNA组和PBS组，每组各16只。分别向裸鼠瘤体内注射 Lv-shRNA-LIMK-1慢病毒颗粒1×108TU/ml100μl、Lv-shRNA-NC慢病毒颗粒1×108TU/ml100μl和PBS100μl。注射慢病毒颗粒1周以后，再次将上述三组各均等随机分组为：LIMK1-shRNA+ROS组(A组)和LIMK1-shRNA+NS组(B组)、NC-shRNA+ROS组(C组)和NC-shRNA+NS组(D组)、PBS+ROS组(E组)和PBS+NS组(F组)。其中：ROS为100mg·Kg-1·2d-1灌胃，NS为200μl·2d-1灌胃。同时观察移植瘤体积及随时间生长变化。灌胃28天后颈椎脱臼处死裸鼠，称量肿瘤重量。取瘤体HE染色后观察其形态改变；应用免疫组织化学法检测 sp法检测肿瘤组织中的 LIMK-1、Cofilin-1蛋白的表达；Western blot检测肿瘤组织中的LIMK-1蛋白。
　　结果：
　　1.成功构建人胃癌 MGC803细胞裸鼠移植瘤模型，六组裸鼠成瘤情况为：A组8只、B组8只、C组8只、D组5只、E组6只和F组5只。
　　2.六组皮下移植瘤生长曲线表明：A组与C组、E组比较，A组裸鼠移植瘤瘤体生长速度减慢（P＜0.05），C组和E组间差异无统计学意义（P＞0.05）。B组与D组、F组比较，B组裸鼠皮下移植瘤瘤体生长速度减慢（P＜0.05）；D组和F组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。E组和F组、C组和D组两两比较，前者移植瘤生长速度明显小于后者（P＜0.05）。HE染色显微镜下确认切取肿瘤组织为胃癌皮下移植瘤瘤组织。
　　3.免疫组织化学法检测LIMK-1蛋白结果显示：A组与C组、E组比较，C组和E组肿瘤细胞胞质中可见较多的浅棕黄色颗粒沉着，差异无统计学意义（P＞0.05），而A组的肿瘤细胞胞质中可见少量的浅棕黄色颗粒沉着（P＜0.05）。B组与D组、F组比较，D组和F组肿瘤细胞胞质中可见大量散在的棕褐色颗粒沉着，差异无统计学意义（P＞0.05），而 B组的肿瘤细胞胞质可见较多浅棕黄色颗粒沉着（P＜0.05）。E组和F组、C组和D组两两比较，前组的肿瘤细胞胞质可见较多的浅棕黄色颗粒沉着，后组的肿瘤细胞胞质中可见大量棕褐色颗粒沉着（P＜0.05）。
　　4.Western blot检测LIMK-1蛋白：A组与C组、E组比较，A组的肿瘤细胞中 LIMK-1蛋白相对表达量明显小于 C组和 E组，差异有统计学意义（P＜0.05），C组和E组间差异无统计学意义（P＞0.05）。B组与D组、F组比较， B组的肿瘤细胞中LIMK-1蛋白相对表达量明显小于D组和F组，差异有统计学意义（P＜0.05），D组和F组差异无统计学意义（P＞0.05）。E组和F组、C组和D组两两比较，前者LIMK-1蛋白相对表达量明显小于后者（P＜0.05）。
　　5.免疫组织化学法检测Cofilin-1蛋白结果显示：A组、B组、C组、D组、E组、F组六组移植瘤肿瘤细胞胞质均中可见大量的棕褐色颗粒沉着，无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.罗格列酮能抑制人胃癌MGC803细胞裸鼠皮下移植瘤生长。
　　2.瘤内注射LIMK-1沉默基因慢病毒颗粒在体内能稳定表达，且能抑制人胃癌MGC803细胞裸鼠皮下移植瘤生长。
　　3.LIMK-1基因沉默与罗格列酮具有协同抑制人胃癌 MGC803细胞裸鼠移植瘤生长。
　　4.罗格列酮抑制人胃癌 MGC803细胞裸鼠移植瘤生长可能与下调 LIMK-1的表达有关。

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主要英文缩略语索引

目录

第一章 前言

第二章 实验材料

1.主要材料与仪器

第三章 实验方法

1.1 MGC803细胞传代培养

1.2 细胞计数法

1.3 实验动物饲养

1.4 构建人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤动物模型及实验分组

1.5 HE染色观察人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤组织病理学

1.6 免疫组织化学法霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连结（SP）法检测各组人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤中LIMK-1表达。

1.7 免疫组织化学法霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连结（SP）法检测各组人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤中Cofilin-1表达。

1.8 Westernbolt检测各组人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤中LIMK-1表达。

1.9 统计学方法

第四章 实验结果

1.重组慢病毒颗粒 Lv-shRNA-LIMK1 对罗格列酮抑制人胃癌 MGC803细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响：

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

文献综述:罗格列酮治疗与预防消化系统肿瘤最新进展

攻读硕士期间发表的论文

致谢