雷帕霉素对早产鼠高氧肺损伤纤维化过程中的抑制作用及mTOR信号机制

摘要

目的:探讨高氧、雷帕霉素干预后转化生长因子β（TGF-β）、结缔组织生长因子（CTGF）和胶原蛋白1（COL1）的表达变化及雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路下游靶蛋白P70S6K和4EBP1的水平变化，了解mTOR信号通路及其阻断剂雷帕霉素对早产鼠氧化应激性肺损伤纤维化修复过程的影响及机制。
　　方法:采用90%氧诱导新生早产鼠肺损伤模型，光镜下观察正常空气组、高氧暴露3、7、14d组及雷帕霉素干预后正常空气组、高氧暴露3、7、14d组肺组织病理学改变及病理评分变化，应用ELISA检测各组肺组织中TGF-β、CTGF与COL1的含量变化。同时应用Western blot和RT-PCR检测雷帕霉素处理后高氧暴露下肺组织中mTOR通路上游复合物mTORC1和下游关键分子P70S6K、4EBP1的蛋白表达情况及基因表达水平。
　　结果:1、肺组织病理改变及病理评分变化：高氧暴露3、7、14d各时间点早产鼠较正常空气对照组体重减轻；光镜下观察发现正常空气对照组肺组织细胞核及细胞质清晰、分布均匀，未见病理改变；高氧暴露3d肺组织细胞核清晰，但可见少许炎性细胞，肺泡开始出现间隔断裂；高氧暴露7d肺泡间隔断裂严重，肺泡开始出现融合现象，大量的炎性细胞浸润；高氧暴露14 d肺组织呈网状分布，气管、血管等有增厚现象，细胞核细胞质分布杂乱，大量的肺成纤维细胞增生；雷帕霉素干预后正常空气组肺组织未见病理改变与单纯空气组一致；雷帕霉素干预后高氧暴露3d肺组织细胞质、细胞核清晰且分布均匀，气管、肺动脉等都清晰正常，可见有极少肺泡间隔断裂；高氧7d+雷帕霉素组可见大量空泡，气管、动脉等增厚，细胞核细胞质分布紊乱，有肺泡融合现象；高氧14d+雷帕霉素组可见细胞质、细胞核分布紊乱，肺泡间隔大量断裂，肺泡融合严重。高氧暴露3、7、14d肺组织病理评分较空气对照组比较，明显升高（p＜0.01），病理评分的高低与吸氧时间成正相关，在高氧14d时病理评分最高；雷帕霉素干预后高氧暴露3、7d的早产鼠肺组织病理评分均低于同时间点高氧暴露组（p＜0.05），差异有统计学意义，然而14 d时雷帕霉素干预组较单纯高氧组比较肺损伤变化差异并不明显（p＞0.05）。
　　2、ELISA检测各组早产鼠肺组织中TGF-β、CTGF与COL1的含量变化：早产鼠在高氧暴露3、7、14d后肺组织中TGF-β、CTGF与COL1的含量均明显高于空气对照组（p＜0.05），且随着高氧暴露时间越长，肺组织中TGF-β、CTGF与COL1的含量越高；雷帕霉素处理后高氧（3、7、14d）组与同时间点单纯高氧暴露组比较早产鼠肺内TGF-β、CTGF及COL1的含量明显减少（p＜0.01）。
　　3、各组早产鼠肺组织中mTORC1、P70S6K和4EBP1蛋白表达水平及mRNA的含量：高氧3d+雷帕霉素组mTORC1、P70S6K和4EBP1蛋白表达水平下降，与高氧3d组比较，差异有统计学意义（p＜0.05），高氧7、14d+雷帕霉素组mTORC1、P70S6K和4EBP1蛋白表达水平较高氧3d+雷帕霉素组下降（p＜0.01）；雷帕霉素干预后高氧暴露3d mTOR通路关键上下游 mTORC1、P70S6K和4EBP1mRNA表达下降，与高氧3d组比较，差异具有统计学意义（p＜0.05）；高氧7、14d+雷帕霉素组mTORC1、P70S6K和4EBP1mRNA表达明显较高氧3d+雷帕霉素组下降（p＜0.01）。
　　结论:1、90%浓度氧暴露早产鼠肺组织充血，肺间隔断裂，肺成纤维细胞增生，同时肺组织中TGF-β、CTGF及COL1含量增加，提示TGF-β、CTGF及COL1参与了高氧肺损伤纤维化修复过程。
　　2、雷帕霉素可以减少肺组织相关致纤维化因子TGF-β、CTGF的合成，同时改善新生早产鼠高氧肺损伤早期病理损伤程度，有可能作为预防早期BPD有效药物之一。
　　3、雷帕霉素可抑制mTOR信号通路的活化及上下游靶分子mTORC1、P70S6K和4EBP1的表达，可能是减轻早期高氧肺损伤肺纤维化程度机制之一。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

第1章 绪 论

第2章不同时间高氧暴露后相关致纤维化因子的表达及雷帕霉素干预后的影响

2.1 材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 实验分组

2.2.2动物模型的制备

2.2.3 标本收集

2.2.4 肺组织病理学检查

2.2.5肺组织损伤病理评分

2.2.6 ELISA法检测各组早产鼠肺组织中TGF-β、CTGF、COL1的含量。

2.2.7 统计学方法

2.3 实验结果

2.3.1 不同时间高氧暴露及雷帕霉素干预对早产鼠一般状态及体重的影响

2.3.2各组早产儿鼠体重的变化。

2.3.3 不同时间氧暴露后早产鼠肺组织病理学变化及病理损伤评分

2.3.4 不同时间高氧暴露后及雷帕霉素干预后早产鼠肺组织中 TGF-β、CTGF和COL1含量。

2.4 讨论

第3章 雷帕霉素干预对不同时间高氧暴露早产鼠的影响及其mTOR信号通路机制

3.1 实验材料

3.1.1实验动物

3.1.2主要仪器设备

3.1.3主要试剂

3.1.4 Western blot 相关试剂：

3.2 实验方法

3.2.1 实验分组

3.2.2动物模型的制备及肺组织分离

3.2.3 Western blot 检测检测肺组织 mTORC1、P70S6K和4EBP1 蛋白表达

3.2.4 RT-PCR分析相关基因的表达

3.2.5 统计学方法

3.3 实验结果

3.3.1 Western blot分析相关蛋白表达

3.3.2 RT-PCR分析相关基因表达时的差异倍数

3.4讨论

第4章结 论

参考文献

文献综述:细胞信号通路与支气管肺发育不良

攻读学位期间科研成果

致谢