miR-597靶向SFN促进鼻咽癌细胞迁移侵袭

摘要

目的：
　　研究miR-597在鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC)发生发展中发挥的作用，以及其通过调控14-3-3σ（Stratifin,即SFN）对鼻咽癌细胞上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）以及迁移侵袭的影响。
　　方法：
　　（1）生物信息学方法分析预测与SFN结合最可能的miRNA分子，主要通过miRwalk在线软件对miRNA-SFN之间的结合进行分析和预测，通过miRanda软件进行热力学稳定性和序列保守性评分分析，获取可与SFN靶向结合的最佳miRNA。
　　（2）Western blot检测14-3-3σ蛋白在不同转移潜能鼻咽癌细胞系6-10B、5-8F，不同分化潜能鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2四组细胞系中的表达水平；并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测 miR-597在四组鼻咽癌细胞系中的表达水平，分析14-3-3σ和miR-597与不同转移分化水平鼻咽癌细胞系的相关性。
　　（3）通过构建SFN-WT野生型载体及SFN-Mut突变型载体，运用双荧光素酶报告基因系统检测miR-597是否靶向结合SFN3'-UTR，从而分析SFN是否是miR-597的靶基因。
　　（4）通过瞬时转染miR-597 mimic，miR-597 inhibitor及相应阴性对照miR-597 mimic NC,miR-597 inhibitor NC到鼻咽癌细胞系6-10B，western blot检测miR-597高表达及低表达鼻咽癌细胞中14-3-3σ蛋白的表达水平，分析miR-597对14-3-3σ蛋白的调控作用。
　　（5）通过 Western blot检测 EMT相关蛋白 E-cadherin和Vimentin在转染miR-597 mimic和inhibitor以及相应对照组的鼻咽癌细胞系6-10B中的表达情况，分析miR-597的表达对鼻咽癌EMT的影响。
　　（6）通过划痕实验和Transwell迁移侵袭实验来验证miR-597表达的改变对鼻咽癌细胞迁移侵袭的影响。
　　结果：
　　1.生物信息学方法发现符合条件的miRNAs有5个：miR-220c、miR-597、miR-362-3p、miR-329、miR-922。其中，miR-597的序列保守性最好，结合稳定性最强，miR-597是最可能与SFN结合的miRNA。
　　2.Targetscan软件预测发现 miR-597与SFN的结合位点位于 SFN基因的489-495碱基，其结合序列为5'-GUGACAC-3'，与miR-597部分序列一致。
　　3.14-3-3σ蛋白的表达水平在低分化鼻咽癌细胞系CNE2中的表达水平较高分化鼻咽癌细胞系CNE1明显下调（P＜0.05）；与低转移鼻咽癌细胞系6-10B相比，14-3-3σ蛋白在高转移鼻咽癌细胞系5-8F中的表达水平明显下调（P＜0.05）。
　　4.miR-597的表达水平在高转移鼻咽癌细胞系5-8F中高于低转移的6-10B细胞系（P＜0.05），在低分化细胞系CNE2中高于高分化细胞系CNE1（P＜0.05）。
　　5.双荧光素酶报告显示miR-597 mimic能显著抑制SFN野生型载体的荧光强度，miR-597 mimic与SFN突变型载体结合后，miR-597 mimic对突变型载体中荧光强度的抑制程度显著降低，突变型载体中的报告荧光基本恢复。
　　6.miR-597 mimic中14-3-3σ蛋白表达量低于miR-597 mimic NC和未转染组（P＜0.05），而miR-597 inhibitor中14-3-3σ蛋白表达量高于miR-597 inhibitor NC和未转染组（P＜0.05）。
　　7.细胞划痕实验结果显示，miR-597 mimic的迁移距离高于miR-597 mimic NC以及未转染组（P＜0.05）。miR-597 inhibitor迁移距离低于miR-597 inhibitor NC以及未转染组（P＜0.05）。
　　8.Trasnwell迁移实验结果显示，miR-597 mimic的迁移细胞数量高于miR-597 mimic NC以及未转染组（P＜0.05）。同样，miR-597 inhibitor迁移细胞数量低于miR-597 inhibitor NC和未转染组（P＜0.05）。
　　9.Trasnwell侵袭实验结果显示，miR-597 mimic的侵袭细胞数量高于miR-597 mimic NC以及未转染组（P＜0.05）。miR-597 inhibitor侵袭细胞数量低于miR-597 inhibitor NC和未转染组（P＜0.05）。
　　10.与miR-597 mimic NC和未转染组比较,miR-597 mimic显著降低E-cadherin的表达，但增加了Vimentin的表达（P＜0.05）；与上调结果相一致，miR-597 inhibitor使E-cadherin的表达增加，Vimentin的表达下调（P＜0.05）。
　　结论：
　　(1)在鼻咽癌细胞系中14-3-3σ低表达，miR-597高表达，两者的表达与鼻咽癌细胞的转移分化密切相关。
　　(2)在鼻咽癌细胞系中miR-597过表达，14-3-3σ的表达减少；下调miR-597的表达，14-3-3σ表达增加，两者表达具有相关性。
　　(3) miR-597能与SFN的3'-UTR结合，SFN是miR-597的靶基因；miR-597负调控SFN促进鼻咽癌细胞的迁移侵袭。

目录

声明

本研究基金资助项目

主要英文缩略词索引

第一章 前 言

1.1 鼻咽癌的病因及诊疗状况

1.2 miRNA在肿瘤中的研究进展

1.3 14-3-3σ与肿瘤的关系

1.4 上皮间质转化（EMT）在肿瘤中的研究进展

1.5 前期工作基础

1.6研究内容

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

第三章 结 果

3.1 生物信息学分析预测与SFN结合的最佳miRNA分子

3.2 预测miR-597与SFN的结合位点

3.3 四组鼻咽癌细胞系中14-3-3σ的表达水平

3.4 四组鼻咽癌细胞系中miR-597的表达水平

3.5 miR-597靶向结合SFN 3'-UTR的检测

3.6 miR-597对14-3-3σ表达水平的影响

3.7 miR-597对鼻咽癌EMT的影响

3.8 miR-597靶向SFN对鼻咽癌迁移侵袭的影响

第四章 讨 论

4.1 miRNA与鼻咽癌发生发展的关系

4.2 miR-597在肿瘤中的研究现状

4.3 miR-597与14-3-3σ在鼻咽癌转移分化中的作用

4.4 miR-597与14-3-3σ相互关系

4.5 miR-597对鼻咽癌EMT的影响

4.6 miR-597对鼻咽癌迁移侵袭的影响

第五章 结论

参考文献

综述：microRNA在鼻咽癌中的研究进展

攻读学位期间的科研成果

致谢