MicroRNA let-7b对日本血吸虫病肝纤维化的影响及其作用机制初步研究

摘要

[目的]本研究通过上调体内外microRNA let-7b（let-7b）表达水平，探索let-7b对TβRI的调控及其在日本血吸虫感染中的抗纤维化作用与机制。
　　[方法]利用瞬时转染技术，分别将let-7b mimics、mimics NC及let-7b inhibitor mimics转染至THP-1细胞中，qRT-PCR及western-blot分别检测TβRI mRNA及蛋白表达水平，从细胞水平上鉴定let-7b对TβRI的调控作用。分别构建Lenti-let-7b和Lenti-NC慢病毒载体。将BALB/c小鼠分成4组，分别为：未感染组、PBS组、Lenti-NC组和Lenti-let-7b组，其中PBS组、Lenti-NC组和Lenti-let-7b组中的每只小鼠通过腹部敷贴法感染15±2条尾蚴以构建血吸虫病肝纤维化模型，并在感染血吸虫后第10天分别由尾静脉注射PBS及浓度为1×109 TU/mL的Lenti-NC和Lenti-let-7b慢病毒重组质粒。随后各组小鼠分别在感染后的第4w、6w、8w和10w进行麻醉眼球取血，解剖后剪取肝组织进行实验。利用qRT-PCR分别检测各组小鼠在不同感染时间点肝组织中let-7b、纤维化相关分子TGF-β1、TβRI、colla I和α-SMA以及细胞因子IFN-γ和IL-4 mRNA表达水平；ELISA检测血清中IFN-γ和IL-4水平；western-blot检测肝组织中TβRI蛋白表达水平；HE和Masson染色观察小鼠肝组织病理变化；定量分析小鼠肝组织中羟脯氨酸含量及血清中ALT水平。
　　[结果]在细胞实验中结果显示：转染let-7b mimics可显著抑制THP-1细胞中的TβRI mRNA和蛋白表达，而转染let-7b inhibitor mimics后，TβRI mRNA和蛋白水平显著性增高（P<0.05）。在动物实验中结果显示：感染组小鼠在感染日本血吸虫后第2w、4w、6w、8w和10w，肝组织中let-7b的表达呈逐渐下降趋势，分别是未感染组的0.91,0.59,0.48,0.13,0.08。转染Lenti-let-7b慢病毒载体后， Lenti-let-7b组小鼠肝组织中let-7b的表达显著增高，在感染后第4w，6w，8w和10w其表达水平是未感染组的11.30，5.39，3.93，2.55倍。促纤维化分子检测结果显示：PBS组和Lenti-NC组小鼠肝组织中纤维化相关指标TGF-β1、TβRI、α-SMA和 colla I在感染血吸虫后均显著性高于未感染组（P<0.05）；但Lenti-let-7b组小鼠肝组织中纤维化基因表达水平明显低于PBS组和Lenti-NC组（P<0.05）。HE和Masson染色结果显示：血吸虫感染第6w后，虫卵肉芽肿及纤维化等病变以PBS组和Lenti-NC组最为严重，且随着感染时间的延长病变加重；而Lenti-let-7b组病变程度明显轻于PBS和Lenti-NC组。肝损伤指标定量分析结果显示：PBS和Lenti-NC组小鼠肝组织羟脯氨酸含量在血吸虫感染后显著性高于未感染组（P<0.01），且随感染周期延长逐渐增加；Lenti-let-7b组小鼠肝组织中羟脯氨酸含量在感染血吸虫后第6w~10w显著性低于PBS和Lenti-NC组（P<0.05）。PBS和Lenti-NC组小鼠血清ALT水平于感染后第4w和第6w显著性高于未感染组（P<0.05）；Lenti-let-7b组小鼠血清中ALT水平分别在感染血吸虫后第4w和第6w显著性低于PBS和Lenti-NC组（P<0.05）。细胞因子检测结果显示：PBS和Lenti-NC组小鼠肝组织和血清中IFN-γ在感染第4w和第6w显著性高于未感染组（P<0.05），于第4w达峰值（P<0.01）；血吸虫感染第4w~8w，PBS和Lenti-NC组小鼠肝组织和血清中IL-4水平均显著性高于未感染组（P<0.05），于第8w达峰值（P<0.01），而Lenti-let-7b组小鼠中IL-4表达在感染血吸虫第4w和第8w明显低于PBS和Lenti-NC组（P<0.05）。
　　[结论]上调小鼠体内let-7b表达可明显减轻日本血吸虫诱导的肝纤维化及炎症反应，作用机制可能与let-7b调节TβRI和减少促纤维化因子表达有关。

目录

声明

常用的英文缩写

第1章 绪论

第2章 实验材料

2.3 细胞

2.4 病毒质粒

2.5 主要实验试剂

2.6 引物设计

第3章 实验方法

3.1 THP-1细胞复苏、培养及冻存

3.2 mimics瞬时转染THP-1细胞

3.3动物模型构建

3.4荧光定量PCR检测let-7b miRNA、纤维化指标及炎症因子的表达

3.5免疫印迹法检测TβRI表达

3.6肝组织羟脯氨酸含量测定

3.7血清ALT含量检测

3.9组织病理学检测

3.10 ELISA检测小鼠血清中IL-4及IFN-γ的表达水平

3.11统计学方法处理数据

第4章 实验结果

4.1 上调let-7b表达对THP-1细胞中TβRI的影响

4.2 Let-7b在日本血吸虫感染小鼠肝组织中的表达

4.3 上调小鼠体内Let-7b表达对日本血吸虫诱导的肝纤维化的影响

4.4 上调小鼠体内let-7b的表达对细胞因子的影响

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

综述:TGF-β与转录因子在肝纤维化中的相互作用

本研究受以下课题资助：

研究成果及论文

致谢