海马Warburg效应通过改善海马突触可塑性介导硫化氢的抗抑郁作用

摘要

目的： 抑郁症是一种常见的心理精神疾病，与慢性应激诱导的脑内海马突触可塑性紊乱密切相关。硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)作为一种新颖的神经调质，对突触可塑性具有重要的调节作用。本课题组已证实H2S可拮抗慢性应激性抑郁，但具体机制仍未明确。有氧条件下的糖酵解称为Warburg效应，可促进突触可塑性的形成。因此，我们将从海马Warburg效应-突触可塑性的新视角深入探讨H2S的抗抑郁作用机制。 方法： 1.采用慢性不可预测温和应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)建立大鼠慢性应激性抑郁模型； 2.抑郁样行为学糖水偏好、高架十字迷宫及悬尾试验用于评价大鼠的抑郁程度； 3.蛋白免疫印迹法(Western blotting)和免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)检测海马突触可塑性相关蛋白：突触后致密蛋白-95(Postsynaptic density protein-95,PSD95)和突触蛋白-1(Synapsin-1,Syn-1)的表达； 4.透射电镜检测海马突触密度和超微结构； 5.Western blotting检测大鼠海马组织Warburg效应相关蛋白己糖激酶2(Hexokinase2,HK2)、M2型丙酮酸激酶(Pyruvate kinase M2,PKM2)、乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)、丙酮酸脱氢酶激酶1(Pyruvate dehydrogenase kinase1,PDK1)以及丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)的表达； 6.乳酸试剂盒(Lactate Assay Kit)检测海马乳酸含量。 结果： 1.H2S对CUMS大鼠海马突触可塑性紊乱的改善作用 CUMS明显降低大鼠的海马突触可塑性相关蛋白PSD95和Syn-1的表达水平，以及降低海马CA1和CA3区的突触密度、突触活动区长度、突触后致密物厚度，增加突触间隙宽度，表明慢性应激性抑郁可诱导海马突触可塑性障碍；H2S供体硫氢化钠(Sodium hydrosulfide,NaHS,30,100μmol/kg,i.p.)明显增加CUMS大鼠PSD95和Syn-1蛋白表达水平以及海马突触密度、突触活动区长度、突触后致密物厚度，缩短突触间隙宽度，表明H2S可改善CUMS诱导的海马突触可塑性紊乱。 2.H2S对CUMS大鼠海马Warburg效应的促进作用 CUMS明显下调大鼠的海马Warburg效应相关蛋白HK2、PKM2、PDK1、LDHA的表达水平明显降低，上调PDH蛋白表达，而且降低CUMS大鼠海马乳酸含量，表明在CUMS大鼠中海马Warburg效应明显受阻；NaHS(30,100μmol/kg,i.p.)明显上调CUMS大鼠HK2、PKM2、PDK1、LDHA蛋白表达，下调PDH蛋白表达以及增加CUMS大鼠海马乳酸含量，表明H2S具有促进CUMS大鼠海马Warburg效应的作用。 3.Warburg效应抑制剂2DG可取消H2S对CUMS大鼠海马Warburg效应的促进作用 Warburg效应抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-dexyglucose,2DG,100mg/kg,i.p.)明显逆转NaHS(100μmol/kg,i.p.)对CUMS大鼠海马HK2、PKM2、PDK1、LDHA蛋白表达的上调作用、对CUMS大鼠海马PDH蛋白表达的下调作用、对CUMS大鼠海马乳酸含量的增加作用，表明2DG可取消H2S对CUMS大鼠海马Warburg效应的促进作用。 4.2DG阻断H2S对CUMS大鼠海马突触可塑性的改善作用 2DG(100mg/kg,i.p.)逆转NaHS(100μmol/kg,i.p.)对CUMS大鼠海马PSD95和Syn-1蛋白表达的上调作用、对CUMS大鼠海马CA1和CA3区的突触密度、突触活动区长度和突触后致密物厚度的增加作用，以及对CUMS大鼠海马突触间隙宽度的降低作用，表明取消H2S对CUMS大鼠海马Warburg效应的促进作用可逆转H2S对CUMS大鼠海马突触可塑性的改善作用。 5.2DG逆转H2S对CUMS大鼠抑郁样行为的拮抗作用 在糖水偏好试验中，2DG(100mg/kg,i.p.)明显逆转NaHS(100μmol/kg,i.p.)对CUMS大鼠糖水偏好率的增加作用；在高架十字迷宫试验中，2DG(100mg/kg,i.p.)明显逆转NaHS(100μmol/kg,i.p.)对CUMS大鼠进入开壁次数百分比和停留时间的增加作用，但不影响各组大鼠进入开闭壁的总次数；在悬尾试验中，2DG(100mg/kg,i.p.)明显抑制NaHS(100μmol/kg,i.p.)对CUMS大鼠不动时间的减少，表明2DG(100mg/kg,i.p.)可逆转NaHS(100μmol/kg,i.p.)对CUMS大鼠抑郁样行为的拮抗作用。上述结果表明取消H2S对CUMS大鼠海马Warburg效应的促进作用可逆转H2S对CUMS大鼠抑郁样行为的拮抗作用。 结论： 海马Warburg效应通过改善海马突触可塑性介导H2S的抗抑郁作用。

目录

声明

缩略词

第1章 绪论

1.1 H2S具有抗抑郁作用，但机制未知

1.2 突触可塑性在抑郁症中的重要作用

1.3 Warburg效应：抗抑郁新机制？

1.4本课题的科学假说和研究思路

第2章 材料与方法

2.1.1 主要试剂

2.1.2主要仪器和设备

2.1.3 实验动物

2.2 药品与试剂的配制

2.2.1 PBS缓冲液的配制

2.2.2 NaHS母液的配制

2.2.3 2DG

2.2.4多聚甲醛的配制

2.2.5戊巴比妥钠的配制

2.2.5电泳缓冲液的配制

2.2.6湿转膜液的配制

2.2.7 10%过硫酸铵(AP) 的配制

2.2.8 TBST 的配制

2.2.9 5%脱脂牛奶封闭液的配制

2.3 实验方法

2.3.1 CUMS造模

2.3.2 行为学检测

3.5大鼠心脏灌流固定取脑

3.6 免疫组织化学检测大鼠海马突触可塑性相关蛋白PSD95和Syn-1的表达

3.7 制取大鼠海马组织匀浆

3.8 Western blot 检测大鼠海马组织 HK2、PKM2、PDK1、LDHA、PDH、PSD95和Syn-1蛋白的表达水平

3.9透射电镜检测海马突触密度和超微结构

3.10乳酸试剂盒检测海马含量

3.11统计分析

第3章 结果

3.1 H2S改善CUMS大鼠海马突触可塑性

3.2 H2S增强CUMS大鼠海马Warburg效应

3.3 2DG逆转H2S对CUMS大鼠海马Warburg效应的增强作用

3. 4 2DG逆转H2S对CUMS海马突触可塑性的改善作用

3.5 2DG逆转H2S对CUMS诱导大鼠抑郁样行为的拮抗作用

3.5.1 2DG逆转H2S对CUMS大鼠糖水偏好率的增加作用

3.5.2 2DG逆转H2S对CUMS大鼠进入高架十字迷宫开壁的次数百分比和停留时间的增加作用

3.5.3 2DG逆转H2S对CUMS大鼠悬尾不动时间的减少作用

第4章 讨论

4.1 H2S可减轻慢性应激大鼠海马突触可塑障碍

4.2 海马Warburg效应通过增强海马突触可塑性参与H2S的抗慢性应激性抑郁作用

第五章 结论

参考文献

文献综述:突触可塑性在神经退行性疾病中的研究发展

攻读硕士期间的发表的论文

致谢