二氢杨梅素抑制内质网应激保护肝细胞氧化损伤

摘要

目的: 观察二氢杨梅素（Dihydromyrieetin,DMY）对过氧化氢（Hydrogen peroxide solution,H2O2）诱导的人正常肝细胞系L02肝细胞氧化损伤的影响及机制，为肝损伤的防治提供新的途径和策略。 方法: 培养人正常肝细胞系L02肝细胞用于实验，第一步：采用10、20、40、80、160和320μg/mLDMY预处理L02肝细胞24h后，以H2O2（200μmol/L）处理L02肝细胞12h。光学显微镜观察细胞形态的变化，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT）法检测细胞活力，比色法测量细胞培养液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的水平，流式细胞术检测细胞凋亡，流式细胞术检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平，比色法测量细胞中丙二醛（malondialdehyde,MDA）的水平。采用Western blot检测L02肝细胞中内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）标志蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein78,GRP78）和C/EBP同源蛋白（CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein,CHOP）的表达。第二步：采用2μg/mL内质网应激诱导剂衣霉素处理LO2细胞30min后，以80μg/mL DMY预处理L02肝细胞24h，再以H2O2（200μmol/L）处理L02肝细胞12h，MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，比色法测量细胞培养液中LDH的水平。 结果: 1、DMY（10、20、40、80、160和320μg/mL）单独处理没有明显影响细胞形态。H2O2处理后细胞形态明显改变，大部分细胞呈圆形，部分细胞呈现凋亡形态学特征,染色体聚集在细胞核膜周边,胞浆收缩，细胞变小。40、80、160和320μg/mL DMY预处理改善了H2O2诱导的细胞形态变化。 2、DMY（10、20、40、80、160和320μg/mL）单独处理与空白对照组比较细胞活力差异没有统计学意义（均P＞0.05）。与H2O2组比较，DMY（40、80、160和320μg/mL）+H2O2组细胞的活力增加（均P＜0.05）。与H2O2组比较，DMY（10、20μg/mL）+H2O2组细胞活力的差异没有统计学意义（均P＞0.05）。 3、与空白对照组比较，H2O2组细胞凋亡率、细胞上清液中LDH水平、细胞中MDA和ROS水平均增加（均P＜0.05）；与H2O2组比较，DMY（80μg/mL）+H2O2组细胞凋亡率、细胞上清液中LDH水平、细胞中MDA和ROS水平均降低（均P＜0.05）。 4、与空白对照组比较，H2O2组细胞中细胞中内质网应激相关相关蛋白CHOP和GRP78表达增加（均P＜0.05）；与H2O2组比较，DMY（80μg/mL）+H2O2组细胞中CHOP和GRP78的表达下降（均P＜0.05）。 5、与H2O2+DMY（80μg/mL）组比较，H2O2+DMY（80μg/mL）+衣霉素（2μg/mL）组细胞活力降低（P＜0.05），细胞凋亡率和细胞培养液上清中LDH活性增加（均P＜0.05）。 结论: DMY通过抑制内质网应激保护H2O2诱导的人正常肝细胞L02氧化损伤。

目录

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缩略词

第1章 绪论

1.1.肝脏细胞氧化损伤是多种肝脏疾病共同的病理生理学特征

1.2. 过氧化氢是诱导肝细胞氧化损伤的常用药物

1.3. 二氢杨梅素具有保护肝脏的作用，但其机制不清

1.4. 内质网应激介导了肝细胞氧化损伤的发病机制

1.5.问题提出和拟开展的研究

第2章.材料与方法

2. 1试剂和仪器

2.1.1主要药品及试剂

2.1.2主要仪器

2.2 实验中主要溶液的配制

2.2.1上样缓冲液

2.2.2 TBE缓冲液

2.2.3 TBST缓冲液

2.2.4磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer, PBS）

2.2.5细胞裂解液

2.3 实验方法

2.3.1细胞培养

2.3.2 实验分组

2.3.3 MTT法检测细胞活力

2.3.4 比色法测量细胞培养液中乳酸脱氢酶的水平

2.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡

2.3.6 流式细胞术检测细胞内活性氧水平

2.3.7 比色法测量细胞中丙二醛的水平

2.3.8Western blot

2.3.9 统计学方法

第3章 结果

3.1 DMY和H2O2对L02细胞形态的影响

3.2 DMY和H2O2对L02细胞活力的影响

3.3 DMY对H2O2诱导L02细胞凋亡的影响

3.4 DMY和H2O2对L02细胞培养液上清中LDH活性的影响

3.5 DMY和H2O2对L02细胞中ROS水平的影响

3.6 DMY和H2O2对L02细胞中MDA水平的影响

3.7 DMY和H2O2对L02细胞中内质网应激相关蛋白CHOP表达的影响

3.8 DMY和H2O2对L02细胞中内质网应激相关相关蛋白GRP78的表达的影响

3.9内质网应激诱导剂衣霉素能够逆转DMY对H2O2诱导L02细胞氧化损伤的保护作用

3.9.1 衣霉素逆转L02细胞的细胞活力

3.9.2衣霉素逆转L02细胞的细胞凋亡

3.9.3衣霉素逆转L02细胞培养液上清中LDH活性

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

综述:内质网应激与肝脏疾病

致谢