孕激素受体基因多态性与子宫内膜癌的相关性研究

摘要

目的： 建立筛查孕激素受体基因+331G/A与G1978T多态性的技术平台用于子宫内膜癌患者的基因分型，研究孕激素受体基因启动子+331G/A多态性对PRA、PRB的mRNA与蛋白表达的影响，探索+331G/A多态性与子宫内膜癌发生、发展的相关性。 方法： 先提取正常人血液DNA为模板，设计+331G/A和G1978T两位点定点突变引物，依据重叠PCR定点突变原理，得到含突变型+331A、1978T的PGR基因融合片段，DNA测序进行验证。以构建的重组基因片段为模板分别设计+331G/A和G1978T两位点的野生型检测引物和突变型检测引物，并在3，端进行硫化修饰，设计正交设计方案，从引物量，模板量，退火温度、循环数方面，确定分子开关对两位点多态性检测的最佳条件。然后在最佳检测条件下对正常人全血DNA及子宫内膜癌患者全血DNA中PGR基因+331G/A和G1978T两多态性位点进行基因分型。然后对正常子宫内膜组织及子宫内膜癌患者癌变组织的总RNA进行提取，运用荧光定量PCR检测其mRNA的表达情况。并对组织蛋白进行提取，运用Western Blot对其蛋白的表达情况进行检测。最后进行统计，分析PGR两位点多态性与子宫内膜癌发生发展的相关性。 结果： 1、利用重叠PCR进行定点突变成功建立的PGR基因两位点的突变型基因片段模板。成功建立分子开关技术对PGR基因+331G/A和G1978T两位点进行基因分型的最佳反应条件，在最佳反应条件下，分子开关现象明显，即当（野生型/突变型）特异性检测引物与DNA模板完全匹配时，凝胶电泳会出现对应条带，即有PCR产物；反之，不完全匹配时，凝胶电泳则没有条带，即无PCR产物。 2、分子开关对66例正常人全血DNA和62例子宫内膜癌患者全血DNA中PGR基因两位点进行基因分型中发现，收集的子宫内膜癌患者血液样本中+331G/A多态位点的基因型频率分别为GG（93.55%）、GA+AA(6.45%)，与对照组GG（90.91%）、GA+AA（9.09%）相比，其差异没有统计学意义（P＞0.05）。其G等位基因在子宫内膜癌患者组与对照组的频率分别为94.70%、95.97%，A等位基因在两组的频率分别为5.30%、4.03%，两组之间等位基因频率的分布差异不具有统计学意义（P＞0.05）。 3、收集的子宫内膜癌患者血液样本中G1978T多态位点的基因型分布频率分别为GG（100.00%）、GT+TT(0.00%)，与对照组GG（96.97%）、GT+TT（3.03%）相比，其差异没有统计学意义（P＞0.05）。其G等位基因在子宫内膜癌患者组与对照组的频率分别为97.73%、100.00%，T等位基因在两组的频率分别为2.27%、0.00%，两组之间等位基因频率的分布差异不具有统计学意义（P＞0.05）。 4、荧光定量PCR结果显示与对照组（正常子宫内膜组织）相比，子宫内膜癌患者PRB、PR、PRA的mRNA水平（0.396、0.306、0.237）显著降低（P＜0.05），而PRA/PRB值在两组间的差异则不具有统计学意义(P＞0.05)。进一步分析显示PRB、PR mRNA在GA+AA组与GG中的相对表达量差异均不具有统计学意义（P＞0.05），而PRA mRNA及PRA/PRB比值在GA+AA组的表达与GG组相比有显著增高（P＜0.05）。 5、Western blot的结果显示，子宫内膜癌患者PRA、PRB蛋白表达水平与对照组相比均明显降低（P＜0.05），而子宫内膜癌患者GG组与GA+AA组相比，其PRB的水平明显升高（P＜0.05），而PRA在两组间的差异则不具有统计学意义（P＞0.05）。关于PRA/PRB比值，与对照组相比，GG组与GA+AA组PRA/PRB比值有显著升高（P＜0.05），而两组之间相比，有明显的降低(P＜0.05)。 结论： 1、成功建立了检测PGR基因+331G/A，G1978T多态性的技术平台。 2、中国人群中子宫内膜癌与PGR基因+331G/A，G1978T两个SNP位点的多态性可能无关。 3、子宫内膜癌的发生和发展可能与PR、PRA、PRB mRNA表达下降，PRA、PRB蛋白表达下降，PRA/PRB比值升高相关。 4、PGR基因启动子+331G/A的多态性对PR、PRB的mRNA表达可能没有影响，但可能影响PRB蛋白表达，进而影响PRA/PRB比值。

目录

声明

主要英文缩略语索引

第1章 绪 论

第2章 实验材料

2.1 主要仪器

2.2 主要试剂

2.3 相关生物信息学分析网站与软件

第3章 实验方法

3.1 主要溶液的配制

3.1.1 50×TAE（母液）缓冲液的配制

3.1.2 PBS缓冲液

3.1.3 制胶

3.2 引物设计

3.2.1 定点突变引物设计

3.2.2 分子开关检测引物设计

3.2.3 荧光定量PCR引物序列

3.3.1 血液标本

3.3.2 子宫内膜组织标本

3.4 血液、组织基因组DNA的抽提

3.5.1 重叠PCR定点诱变原理

3.5.2 重叠PCR定点突变步骤

3.5.3 DNA测序

3.6 正交设计方案确定分子开关检测条件

3.7 利用SNP敏感性分子开关，对DNA样本的检测

3.7.1 SNP敏感性分子开关检测+331G/A位点多态性

3.7.2 SNP敏感性分子开关检测G1978T位点多态性

3.7.2 统计学分析

3.8 荧光定量PCR检测子宫内膜癌癌变组织及正常子宫内膜组织PRA、PRB mRNA的表达

3.8.1 提取组织总RNA

3.8.2 总RNA逆转录形成cDNA

3.8.3 荧光定量PCR

3.8.4 统计学分析

3.9 Western Blot检测子宫内膜癌癌变组织及正常子宫内膜组织PRA、PRB 蛋白的表达

3.9.1 组织蛋白的提取

3.9.2 电泳

3.9.3 转膜

3.9.4 封闭

3.9.5 抗体孵育

3.9.6 结果显影

3.9.7 统计学分析

第4章 实 验 结 果

4.1 基因组DNA的提取

4.2 重叠延伸PCR法构建突变型重组DNA片段结果

4.2.1 重叠PCR法构建+331G/A突变型重组DNA片段结果

4.2.2 重叠PCR法构建G1978T突变型重组DNA片段结果

4.3 正交设计不同PCR方案中分子开关的结果

4.3.1 +331G/A位点正交设计方案结果

4.3.2 G1978T位点正交设计方案结果

4.4 运用SNP敏感性分子开关技术，对正常人及子宫内膜癌患者样本PGR基因SNP位点多态进行基因分型及分析

4.4.1 子宫内膜癌组织患者年龄分布情况

4.4.2 子宫内膜癌组织临床病理特征

4.4.3 子宫内膜癌患者组织病理图

4.4.4 运用SNP敏感性分子开关技术，对提取的DNA进行检测

4.4.5 PGR基因SNP基因型与子宫内膜癌的相关性分析

4.5运用荧光定量PCR检测子宫内膜癌样本PRA、PRB mRNA的表达及分析

4.5.1 组织样本的总RNA提取

4.5.2 荧光定量PCR扩增产物鉴定

4.5.3子宫内膜癌样本PRA、PRB mRNA的表达分析

4.6运用Western Blot检测子宫内膜样本PRA、PRB蛋白的表达及分析

第5章实验讨论

第6章 实验结论

参考文献

综述:孕激素受体基因+331G/A多态性与肿瘤的相关性研究进展

研究生期间科研成果

致谢