铀诱导大鼠肾细胞凋亡的机制以及硫化氢对凋亡的拮抗作用

摘要

目的：铀是一种严重的环境污染物，肾脏是铀富集的主要靶器官，肾功能损伤是铀暴露的显著特征，但是铀诱导肾毒性的分子机制以及保护作用还没有阐述清楚。目前细胞凋亡被认为是铀诱导肾毒性的机制之一，硫化氢（Hydrogen sulfide，H2S）作为一种气体信号分子，具有潜在的抗凋亡作用。本研究有两个目的：（1）阐明铀诱导的肾细胞凋亡的分子机制；（2）探讨H2S对铀诱导肾细胞凋亡的保护作用。 方法：传代培养SD大鼠肾近端小管上皮细胞（NRK-52E），采用MTT法评价细胞活力，分光光度法检测LDH含量，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析细胞凋亡，DCFH-DA荧光探针测定ROS含量，Western blots检测凋亡标志蛋白Caspase-3，内质网应激标志蛋白（GRP78、p-PERK、p-IRE1和ATF6）、内质网应激介导凋亡标志蛋白（CHOP和Caspase-12）、转录因子Nrf2、Akt/GSK3β/Fyn通路相关蛋白（p-Akt、p-GSK3β和Fyn）、以及蛋白酶体系统相关蛋白（PSMA6和PSMB7）的表达。采用500μM乙酰双氧铀染毒肾细胞，在四个时间点（6、12、18和24h）下探讨铀诱导肾细胞凋亡的分子机制。利用200μM生理浓度的NaHS（H2S供体）揭示对500μM乙酸双氧铀诱导的肾细胞凋亡的保护机理。 结果：（1）铀染毒诱导肾细胞产生内质网应激，从而导致肾细胞凋亡；（2）铀染毒打乱Akt/GSK3β/Fyn信号通路，使胞核Nrf2含量下降，介导了肾细胞凋亡。（3）H2S通过抑制铀诱导的内质网应激而拮抗肾细胞凋亡；（4）H2S通过激活Akt/GSK3β/Fyn通路，提高Nrf2活性，激活蛋白酶体系统，从而缓解了内质网应激介导的肾细胞凋亡。 结论：（1）ROS触发的内质网应激和Akt/GSK3β/Fyn-Nrf2信号紊乱介导了铀诱导的肾细胞凋亡。（2）H2S能通过Akt/GSK3β/Fyn-Nrf2信号依赖的蛋白酶体激活，抑制ROS触发的内质网应激，从而拮抗铀诱导的肾细胞凋亡。

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英文缩写词索引

第一章 铀诱导大鼠肾细胞凋亡的分子机制

1.1 引言

1.2 实验材料与仪器

1.2.1 主要试剂

1.2.2 主要仪器

1.2.3 肾细胞系

1.2.4 试剂配制

1.3 实验方法

1.3.1 肾细胞培养

1.3.2 实验分组

1.3.3 细胞活力测定

1.3.4 LDH含量检测

1.3.5 细胞凋亡检测

1.3.6 ROS含量测定

1.3.7 蛋白质印迹

1.3.8 统计学分析

1.4 结果

1.4.1 铀染毒产生肾细胞毒性

1.4.2 铀染毒引起肾细胞凋亡

1.4.3 铀染毒肾细胞产生内质网应激

1.4.4 内质网应激介导铀诱导的肾细胞凋亡

1.4.5 ROS含量减少缓解铀诱导的凋亡和内质网应激

1.4.6 铀染毒扰乱Akt/GSK3β/Fyn通路并使胞核Nrf2含量下降

1.4.7 Akt磷酸化增加缓解铀诱导的肾细胞凋亡

1.4.8 ROS含量减少激活铀抑制的Akt磷酸化

1.5 讨论

1.6 结论

第二章 H2S对铀诱导的大鼠肾细胞凋亡的拮抗作用

2.1 引言

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 主要试剂

2.2.2 主要仪器

2.2.3 试剂配制

2.3 实验方法

2.3.1 实验分组

2.3.2 相关实验

2.4 结果

2.4.1 H2S缓解铀诱导的肾细胞凋亡

2.4.2 H2S抑制铀诱导的肾细胞ROS生成

2.4.3 H2S抑制铀诱导的肾细胞内质网应激

2.4.4 H2S激活铀抑制的Akt/GSK3β/Fyn通路而提高胞核Nrf2含量

2.4.5 Nrf2表达下降逆转H2S对铀抑制的蛋白酶体系统的激活

2.4.6 抑制蛋白酶体系统可逆转H2S对铀诱导内质网应激的拮抗作用

2.5 讨论

2.6结论

创新点及展望

创新点

展望

参考文献

综述:铀诱导的毒性分子机制与防治研究进展

研究生期间发表的学术论文及获奖情况

致谢