鹦鹉热衣原体MOMP、MIP重组核酸菌影疫苗的免疫保护作用

摘要

目的：构建鹦鹉热衣原体（Cps）MOMP和MIP蛋白的重组核酸菌影疫苗，分析其免疫活性及抗Cps感染作用，为Cps疫苗的研制提供实验依据。 方法：构建pET30a-MOMP原核表达载体，诱导表达并纯化重组MOMP蛋白。构建pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核重组质粒，氯化钙法分别将其装载入化学渗透压裂解法制备的E.coli JM109空菌影（BG）中，制备重组核酸菌影pcDNA3.1(+)-MOMP BG和pcDNA3.1(+)-MIP BG；并鉴定其在鼠源性巨噬细胞RAW264.7中的表达。设立PBS和空BG对照组、pcDNA3.1(+)-MOMP、pcDNA3.1(+)-MIP、pcDNA3.1(+)-MOMP BG、pcDNA3.1(+)-MIP BG、pcDNA3.1(+)-MOMP/MIP BG联合免疫和pcDNA3.1(+)-MOMP/MIP BG联合免疫蛋白加免（Heterologous boost，He；即免疫3次后最后一次免疫用重组蛋白加免）实验组，以后腿肌注免疫途径免疫BALB/c鼠，共免疫四次。末次免疫1w后，ELISA法检测各组小鼠特异性抗体IgG效价，CCK-8检测脾细胞增殖水平，ELISA法检测脾细胞上清液中IFN-γ和IL-17A的分泌水平。滴鼻感染1×105IFU的Cps，每天定时观察各组小鼠的毛发状态、活动度变化程度、食欲情况及体重变化程度。感染后4d和10d时颈椎脱臼处死小鼠，无菌取小鼠肺脏，随机选择各组中的小鼠，一半小鼠的肺脏经10%中性甲醛固定、石蜡包埋切片后H&E染色分析其炎症病变程度；另一半小鼠肺组织，匀浆，一部分用于EILSA测定上清中IFN-γ和IL-17A的表达水平；另一部分匀浆超声处理后，间接免疫荧光法检测其中包涵体数量。 结果：成功构建pET30a-MOMP原核表达载体，诱导表达纯化得48KDa左右的目的蛋白。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定化学渗透压裂解法处理过的E.coli JM109胞浆中基本无核酸存在。成功构建的pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核重组质粒经氯化钙法成功装载入菌影中，转染RAW264.7细胞后能表达特异性的目的蛋白。免疫小鼠后，pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP裸核酸免疫组特异性IgG抗体水平、脾细胞刺激指数（SI）和脾细胞产生IFN-γ水平与PBS、空BG对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而各核酸菌影组小鼠这些指标均显著高于对照组（P＜0.05），且联合免疫组亦显著高于pcDNA3.1(+)-MOMP BG或pcDNA3.1(+)-MIP BG单独免疫组，联合免疫蛋白加免组显著高于联合免疫组（P＜0.05）。所有组间脾细胞产生IL-17A的水平差异无统计学意义（P＞0.05）。呼吸道滴鼻感染Cps后，裸核酸免疫组与对照组比较，其肺组织中包涵体数量及炎症病变程度无显著性差异；但4d后核酸菌影疫苗实验组小鼠肺组织包涵体数量及炎症病变程度均显著低于对照组，且联合免疫组显著低于pcDNA3.1(+)-MOMP BG或pcDNA3.1(+)-MIP BG单独核酸菌影免疫组；联合免疫蛋白加免组亦显著低于联合免疫组（P＜0.05）。感染10d后，各组小鼠肺组织中的衣原体均基本完全被清除，肺脏组织的病变也趋于慢性炎症，且实验组的肺组织恢复情况明显优于对照组。 结论：鹦鹉热衣原体MOMP、MIP重组核酸菌影pcDNA3.1(+)-MOMP BG、pcDNA3.1(+)-MIP BG能诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答，发挥一定的抗鹦鹉热衣原体感染的保护效果；联合免疫比单一免疫诱导产生的免疫应答和发挥的保护效果更强，且蛋白加免亦可增强核酸菌影疫苗联合免疫的免疫应答。

目录

声明

主要英文缩写索引

第1章 绪 论

第2章 实验材料

2.1 主要实验仪器

2.2 菌株、细胞株和实验动物

2.3 主要试剂

2.3.1 主要试剂盒

2.3.2 重要实验试剂

2.3.3 其他试剂及耗材

2.3.4 培养基及主要溶液配置

第3章 实验方法

3.1.1 Hela细胞培养

3.1.2 Cps的繁殖培养

3.1.3 Cps-DNA模板的提取

3.1.4 MOMP特异性引物的设计

3.1.5 MOMP基因的PCR扩增

3.1.6 PCR扩增产物的纯化

3.1.7 pET 30a空质粒的提取

3.1.8 PCR扩增产物及pET 30a空质粒的双酶切

3.1.9 纯化回收双酶切产物

3.1.10 PCR产物与pET 30a空质粒酶切后的连接

3.1.11 制备感受态细菌

3.1.12 重组质粒的转化

3.1.13 原核表达载体的筛选与鉴定

3.2 pET 30a-MOMP原核重组蛋白的表达

3.3 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核载体的构建及鉴定

3.3.1 MOMP和MIP基因的PCR扩增

3.3.2 PCR扩增产物的纯化

3.3.3 pcDNA3.1(+)空质粒的提取

3.3.4 PCR扩增产物的纯化及pcDNA3.1(+)空质粒的双酶切

3.3.5 纯化回收双酶切产物

3.3.6 PCR产物与pcDNA3.1(+)空质粒酶切后的连接

3.3.7 制备感受态细菌

3.3.8 MOMP和MIP真核重组质粒的转化

3.3.9 真核重组质粒的筛选与鉴定

3.3.10 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核重组质粒的提取

3.4 化学裂解法菌影（BG）的制备

3.5 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP重组核酸菌影载体的装载构建和鉴定

3.5.1 鼠源性巨噬细胞RAW 264.7细胞的培养

3.5.2 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP重组核酸菌影载体的Western Blot鉴定

3.6 BALB/c小鼠分组及免疫接种

3.7 免疫活性的鉴定

3.7.1 血清特异性IgG抗体滴度检测

3.7.2 小鼠脾淋巴细胞增殖情况的检测

3.7.3 小鼠脾淋巴细胞培养液上清中IFN-γ和IL-17A浓度测定

3.8.1小鼠呼吸道感染Cps

3.8.2 小鼠肺组织病理检测

3.8.3 肺组织匀浆中Cps检测

3.8.4 肺组织匀浆中IFN-γ和IL-17A浓度测定

3.9 统计学处理

第4章 实验结果

4.1.1pET 30a-MOMP原核表达克隆载体的构建

4.1.2 pET 30a-MOMP原核表达克隆载体的诱导表达

4.2 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核重组质粒的构建

4.3 菌影的制备与鉴定

4.4 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核重组核酸菌影载体的Western Blot鉴定

4.5.1 血清特异性IgG抗体水平的测定

4.5.2 CCK-8法检测小鼠脾细胞增殖情况

4.5.3 MOMP、MIP蛋白诱导免疫小鼠脾淋巴细胞上清中IFN-γ和IL-17A的产生水平

4.6 抗感染实验

4.6.1 重组核酸菌影疫苗对Cps感染所引起肺组织病变程度的影响

4.6.2 重组核酸菌影疫苗对肺组织中Cps的影响

4.6.3 重组核酸菌影疫苗对肺组织匀浆中IFN-γ和IL-17A产生水平的影响

第5章 讨论

参考文献

文献综述：白介素12的生物学作用研究进展

附录一

附录二

作者攻读学位期间的科研成果

致谢