sortilin通过ABCA1影响荷脂巨噬细胞胆固醇流出及主动脉粥样硬化病变

摘要

目的：分拣受体sortilin是由SORT1基因编码，属于囊泡分拣因子10（vacuolar protein sorting,Vps10p）结构域受体家族的一种分拣蛋白，能够特异性结合并转运胞内蛋白底物，形成胞内体到达胞膜或介导蛋白底物进入溶酶体降解，参与包括脂质相关蛋白在内多种靶蛋白的表达水平与功能。研究表明，sortilin参与调控细胞内脂质和体内血脂代谢过程，并且与动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的形成密切相关。三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP binding cassette transporter A1,ABCA1）是一种关键的膜转运蛋白，介导巨噬细胞胆固醇从细胞内流出，具有抗AS作用。鉴于ABCA1在体内脂质代谢中的重要作用，探讨sortilin是否调控ABCA1蛋白水平则显得十分必要。本研究选取THP-1源性巨噬细胞和LDLR-/-小鼠作为研究对象，旨在探讨soritlin对ABCA1表达、泡沫细胞形成以及AS的影响。 方法：ox-LDL孵育THP-1源性巨噬细胞，采用qRT-PCR和Western blot方法检测不同浓度ox-LDL（0μg/mL，12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL）处理细胞24h后及ox-LDL处理不同时间（0h，6h，12h，24h，48h）后巨噬细胞内sortilin mRNA和蛋白水平；高表达和沉默THP-1巨噬细胞sortilin后；液体闪烁计数仪检测胞内胆固醇流出情况，免疫共沉淀方法检测sortilin与ABCA1结合情况；高效液相色谱法检测细胞内脂质含量变化；油红O染色观察胞内脂滴形成情况。动物实验中，通过体视显微镜，苏丹IV、HE染色、Masson三色染色、油红O染色探讨LDLR-/-小鼠动脉斑块病变情况。 结果：THP-1巨噬细胞sortilin表达呈ox-LDL剂量和时间依赖性增加；并在50μg/mL ox-LDL处理24h后，THP-1巨噬细胞sortilin表达最显著；sortilin过表达后巨噬细胞胆固醇流出减少，并下调细胞内ABCA1蛋白水平，但对其mRNA水平无显著影响；免疫共沉淀检测结果发现sortilin能与ABCA1结合；进一步研究发现sortilin过表达后增加THP-1巨噬细胞内脂质蓄积。并且与LV-sortilin组相比，加入溶酶体抑制剂氯喹处理后，巨噬细胞ABCA1蛋白水平明显上调，而加入蛋白酶体抑制剂MG132后，巨噬细胞细胞ABCA1蛋白水平无明显改变。相反，使用shRNA沉默sortilin表达后，ABCA1的蛋白水平及其介导的胆固醇流出量明显增加。动物实验结果表明：转染LV-sortilin的小鼠主动脉脂质沉积和斑块面积增加，并且斑块内ABCA1表达减少，而且在转染LV-sortilin的基础上加入LV-ABCA1或溶酶体抑制剂氯喹可逆转这一情况。 结论：sortilin能够抑制ABCA1蛋白表达和胆固醇流出，促进巨噬细胞泡沫化和AS的进展。

目录

声明

主要缩略语及英文索引

第1章 绪 论

第2章 实验材料

2.1 主要实验仪器

2.2 主要实验试剂

第3章 实验方法

3.1 细胞培养

3.2 油红O染色

3.3Western blot检测ABCA1、sortilin的蛋白表达

3.3.1细胞蛋白的的提取

3.3.2 SDS-PAGE电泳

3.3.3 转膜

3.3.4 封闭

3.3.5 抗体孵育

3.3.6显影

3.4 胆固醇流出实验

3.5 qRT-PCR检测mRNA水平

3.5.1总RNA提取及浓度测定

3.5.2逆转录反应

3.5.3 qRT-PCR

3.6 免疫共沉淀

3.7 高效液相液谱分析

3.8 shRNA转染细胞

3.9 慢病毒的构建与转染

3.10 动物实验

3.10.1 组织取材

3.10.2 冰冻切片的制作

3.11 统计学分析

第4章 实验结果

4.1 巨噬细胞荷脂后对sortilin表达的影响

4.2.1 sortilin抑制巨噬细胞内胆固醇流出

4.2.2 sortilin促进巨噬细胞内脂质蓄积

4.2.3 sortilin促进荷脂巨噬细胞泡沫化

4.3.1 sortilin抑制巨噬细胞内ABCA1表达水平

4.3.2 巨噬细胞sortilin与ABCA1结合情况

4.3.3 溶酶体抑制剂处理对sortilin调控巨噬细胞ABCA1蛋白水平的影响

4.3.4 蛋白酶体抑制剂处理对sortilin调控巨噬细胞ABCA1蛋白水平的影响

4.3.5 sortilin通过ABCA1抑制巨噬细胞内胆固醇流出

4.3.6 sortilin通过ABCA1促进巨噬细胞内脂质蓄积

4.3.7 sortilin通过ABCA1促进巨噬细胞泡沫化

4.4.1 sortilin促进LDLR?/?鼠主动脉AS斑块形成

4.4.2 sortilin下调LDLR?/?鼠主动脉ABCA1蛋白水平

第5章 讨 论

第6章 结 论

参考文献

综述:Sortilin: a Novel Regulator in Lipid Metabolism and Atherogenesis

攻读学位期间的科研成果

致谢

课题资助