胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP-4)基因的克隆、表达与蛋白纯化

摘要

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，简称IGFs)，又称类胰岛素样生长因子，是一类多功能细胞增殖调控因子。胰岛素样生长因子系统由IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ、Ⅰ型和Ⅱ型胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor，IGFR)以及与IGF特异性结合的胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin like growth factor binding protein，IGFBP)家族组成，在正常细胞增生和恶性转化过程中发挥重要作用。而胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)是IGF的运输和储存形式，IGF通常与结合蛋白一起产生和分泌，因而IGFBP对于调节游离IGF的浓度及其与受体的结合起着重要作用。 在已发现的10种胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP1-10)中IGFBP-4是分子量最小的，是一个细胞增殖抑制因子，最初是从人的成骨细胞的条件培养液中分离纯化出来的，IGFBP-4主要作用有：调节IGF的作用、在特定的细胞基质中储存IGF、不依赖IGF而发挥作用。 为了获取大量的高纯度的IGFBP-4、降低其生产成本、研究其蛋白功能和体内IGFBP-4的调控机制奠定基础。采用基因重组表达是获得大量目的蛋白的主要途径，本研究将用化学合成法合成IGFBP-4基因片段，通过PCR对其进行扩增，并构建载体与该目的基因相连接，插入pGEX-6p-1融合蛋白表达载体中，构建重组质粒pGEX/-6p-1-IGFBP-4。经转化宿主菌BL21，筛选高效率转化子，摇瓶培养，将所构建的IGFBP-4表达质粒，经IPTG(isopropyl-1-thio-beta-D-galactoside)诱导表达，收集细胞裂解、SDS-PAGE电泳检测结果表明，IGFBP-4成功获得表达。进一步对诱导时间、诱导温度和培养基pH值进行优化，通过SDS-PAGE检测确定了最适表达条件为16℃，pH9.5，20h，0.2mM IPTG，此条件下上清目的蛋白的表达总量最高，表明IGFBP-4在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达。得到的融合蛋白可以经亲和层析进行分离纯化。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一篇前言

1胰岛素样生长因子的研究进展及应用

2胰岛素样生长因子结合蛋白的研究进展及应用

第二篇实验研究

1引言

2技术路线

第一部分:pGEX-6P-1／IGFBP-4原核表达载体的构建

1实验材料

2实验方法

第二部分:pGEX-6P-1／IGFBP-4在大肠杆菌中的表达、纯化

1实验材料

2试验方法

结论

参考文献

附录

致谢

作者简历