MEG3通过miR-125a-5p/TET2途径抑制HepG2细胞载脂蛋白(a)的表达

摘要

目的：前期研究发现miR-125a-5p靶向抑制去甲基化酶TET2的表达，且TET2可抑制HepG2细胞apo(a)的表达，而生物信息学分析表明，MEG3可与miR-125a-5p互补性结合，故MEG3存在抑制miR-125a-5p的可能性，推测MEG3可通过抑制miR-125a-5p，上调TET2，从而发挥抑制HepG2细胞apo(a)表达的作用。拟在高表达apo(a)的HepG2细胞上，检测MEG3的表达水平，并分析转染MEG3后apo(a)的表达情况，并从MEG3/miR-125a-5p/TET2途径研究MEG3调控apo(a)的分子机制。 方法：本研究首先用生物信息学在线软件Targetscan分析与TET2mRNA3’-UTR靶向结合的miRs，以其结合的保守性强弱和自由能值大小进行筛选，得到候选miR，再以荧光素酶报告基因系统分析和和验证其结合的靶向性；再用荧光素报告酶系统分析MEG3与miR-125a-5p的靶向性结合。MTT法检测细胞活性，采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测高表达apo(a)的HepG2细胞和低表达apo(a)的SMMC7721细胞中MEG3的表达情况；向HepG2细胞转染MEG3，western blot和qRT-PCR检测apo(a)、TET2表达情况；采用小干扰RNA技术沉默TET2的表达。所有数据的统计学分析采用均数±标准差(x±SD)表示，用Graphpad Prism5.0.1对数据进行分析和作图，选取95%可信区间，P<0.05为差异有显著性意义。 结果：①人TET2mRNA的3’-UTR有3个强保守性地hsa-miR-125a-5p的结合位点，在线软件BiBiserv2RNAhybrid可见TET2mRNA3’-UTR与hsa-miR-125a-5p结合的自由能均低于阈值（-10kcal/mol），为-25.5kcal/mol，说明TET2mRNA3’-UTR与hsa-miR-125a-5p有稳定的结合。②荧光素酶报告基因系统分析结果表明：转染hsa-miR-125a-5p能使野生型psiCHECKTM-2-TET2-WT3’UTR质粒的表达水平显著下降，而对突变型psiCHECKTM-2-TET2-Mut3’UTR质粒的表达无影响，这就提示TET2为hsa-miR-125a-5p的靶标基因，hsa-miR-125a-5p通过靶向结合TET2mRNA3’-UT抑制野生型重组质粒的表达。③生物信息学分析结果表明MEG3与hsa-miR-125a-5能互补性结合，荧光素酶报告基因系统分析结果证实了MEG3与hsa-miR-125a-5p结合的存在。④miR芯片结果表明，在HepG2细胞中，hsa-miR-125a-5p表达水平升高，是对照组的近1.5倍，qRT-PCR分析结果表明，高表达apo(a)的HepG2细胞和低表达apo(a)的SMMC7721细胞中MEG3均有表达，但前者MEG3的表达水平显著低于后者。⑤MTT分析结果表明MEG3转染72h才对HepG2细胞产生毒性效用，MEG3转染抑制apo(a)表达。⑥机制研究发现MEG3转染显著下调miR-125a-5p的表达，显著上调TET2的表达和活性；加入miR-125a-5p的mimics可逆转MEG3对apo(a)的下调作用，并抑制TET2的表达和活性，但可被miR-125a-5p的抑制剂逆转；TET2沉默可逆转MEG3对apo(a)的下调作用。 结论：MEG3通过miR-125a-5p/TET2途径下调HepG2细胞apo（a）的表达。

目录

声明

主要缩略语英文索引

第1章 绪 论

第2章 实验材料及实验方法

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养及处理

2.2.2 MTT法细胞活性测定

2.2.3 MEG3转染：参考试剂盒上的试剂说明书进行

2.2.4 萤光素酶报告分析

2.2.5 miRs芯片分析

2.2.6 小干扰RNA转染

2.2.7 实时荧光定量PCR

2.2.8 miR-125a-5p表达分析

2.2.9 蛋白质免疫印迹

2.2.10 细胞免疫荧光

2.2.11 统计学分析结果

第3章 实验结果

3.1 hsa-miR-125a-5p对TET2靶向性的生物信息学分析及验证

3.1.1 hsa-miR-125a-5p在HepG2细胞中高表达

3.1.2TET2 mRNA3’-UTR与miR-125a-5p靶向结合分析及验证

3.2 MEG3与miR-125a-5p结合的生物信息学分析及荧光报告素酶验证

3.3 HepG2细胞MEG3表达分析

3.4 MEG3对HepG2细胞apo（a）表达水平的影响

3.4.1 MEG3对HepG2细胞毒性分析

3.4.2 MEG3对HepG2细胞apo（a）表达水平的影响

3.5 MEG3抑制HepG2细胞apo(a)表达的机制

3.5.1 MEG3抑制miR-125a-5p的表达，miR-125a-5p逆转MEG3对apo(a)表达的下调作用，并下调TET2

3.5.2 MEG3上调HepG2细胞TET2的表达及活性,TET2沉默逆转MEG3对apo(a)表达的下调作用

第4章 讨论

4.1 MEG3的病理生理学意义及作用机制

4.2 TET2酶在动脉粥样硬化中的作用

第5章 结论

参考文献

综述:miRNA调控细胞焦亡在疾病中的作用

攻读学位期间科研成果

致谢