牛副结核病多重组抗原间接ELISA方法的建立及应用

摘要

为了建立一种有效的牛副结核病间接ELISA方法，本研究设计了两对引物，从副结核分枝杆菌P<,18>株的基因组中PCR扩增出两个目的基因map0862和map2154c、，采用重叠延伸剪接技术(splice by overlapping extension，SOE)获得融合基因map0862-2154c。经过多次亚克隆步骤后，将DNA片段map0862-2154c串连于表达载体pET32a(+)中，获得了重组质粒pET0862-2154c。将重组质粒转化BL21 (DE3)大肠杆菌感受态后，经IPTG诱导表达后，以Ni<'2+>鳌合层析的方法纯化融合蛋白。Western blot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应活性。 以融合蛋白作为包被抗原，在确定了最佳封闭液和最佳包被条件后，采用正交试验设计的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀释度，以及最佳一抗、二抗作用时间和显色时间，建立了检测牛副结核病抗体的间接EIASA方法。用95份健康牛血清的检测结果统计分析后确定诊断方法的判定标准，即牛血清样本(mbp0862-2154c) S/P大于0.42为阳性，小于0.34为阴性，两者之间为可疑。 通过对90份牛副结核病血清和100份无副结核病牛血清的检测结果表明，ELISA方法的敏感性为84.44％(76/90)，特异性为97％(97/100)。用确定的间接ELISA方法对50份副结核阴性血清(副结核病试剂盒检测)和54份副结核阳性血清(副结核病试剂盒检测)共104份检测，检测结果进行比较，本方法与牛副结核病试剂盒(IDEXX)诊断的符合率为91.35％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1国内外研究现状

1.1副结核病的概述

1.2牛副结核病的流行和控制

1.3牛副结核病诊断技术的研究进展

1.4牛副结核病的防疫对策

2研究目的和意义

3研究内容和方法

3.1牛副结核分枝杆菌抗原MAP0862和MAP2154c的串连融合表达

3.2间接ELISA诊断方法的初步建立

第二章实验部分

1牛副结核分枝杆菌抗原MAP0862和MAP2154c融合表达

1.1材料和方法

1.2结果

1.3 讨论

1.4小结

2间接ELISA方法的建立及应用

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三章结论

参考文献

附录

致谢

作者简介