苏云金杆菌伴孢晶体20-kb DNA中cry1Ac基因的高效表达和生物活性研究

摘要

已经证实苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体中结合有20-kb DNA,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明.研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体,从中抽提出与其结合的20-kb DNA.经NdeⅠ酶切消化后亚克隆构建文库,利用PCR-RFLP及测序,筛选出含cry1Ac基因的转化子,然后设计引物通过PCR扩增出cry1Ac基因的ORF,并与pET30a连接,转化E.coli BL21(DE3),高效表达了141 KD蛋白,表达蛋白占总蛋白量的50%以上,且90%以上以包涵体形式存在.利用穿梭载体pHT304构建表达质粒pHTX42,电转化Bt无晶体突变株XBU001,获得重组菌株HTX42,经SDS-PAGE分析,cry1Ac基因得到强表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28%,且其在细胞中累积达细胞干重的64.13%,这种产量比文献报道的25%左右增高了一倍以上.原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)检测显示,目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体,大小约为1.2×2.0μm.生测结果显示,包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)三龄幼虫均有高效杀虫活性,其中包涵体以2d的LC<,50>为20.5μg/ml,晶体以2d的LC<,50>为6.25μg/ml.从ETX35菌株的包涵体和HTX42菌株的晶体中分别抽提DNA,并进行PCR鉴定,证明其中的20-kb DNA片段具有序列多态性.该研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20-kb DNA分子的来源、结构和功能奠定了重要的基础.

目录

文摘

英文文摘

引言

1.苏云金芽孢杆菌概论

1.1苏云金芽孢杆菌概述

1.2苏云金芽孢杆菌毒素

1.3 cry基因的表达调控机制

2.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白作用机理

2.1Bt杀虫晶体蛋白的结构

2.2杀虫晶体蛋白活化模式

3.苏云金芽孢杆菌的研究现状

3.1高毒菌株的分离及新基因的克隆表达

3.2Bt基因的融合表达及转基因

3.3杀虫作用机制研究和抗性机理研究

4.立题依据和意义

材料与方法

1.材料

1.1菌株与质粒

1.2培养基和抗生素

1.3试剂和引物

1.4仪器设备

2.方法

2.1菌体培养与伴孢晶体的分离

2.2伴孢晶体的选择性溶解和20-kb DNA的抽提

2.3 20-kb DNA亚克隆文库的构建和PCR-RFLP筛选cry1Ac基因

2.4 cry1Ac基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的克隆表达

2.5 cry1Ac基因在无晶体突变株XBU001中的表达

2.6原子力显微镜(Atomic Force Microscppy,简称AFM)观察

2.7杀虫毒力生测

结果与分析

1.20-kb DNA的抽提

2.20-kb DNA亚克隆文库的构建和PCR-RFLP筛选cry1 Ac基因

3.cry1Ac基因在大肠杆菌中的克隆表达

4.cry1Ac基因在无晶体突变株XBU001中的克隆表达

5.表达产物的检测与分析

5.1原子力显微镜观察

5.2生测

5.3重组晶体中20-kb DNA的抽提与PCR鉴定

讨论

1.选择性溶解晶体和抽提20-kb DNA的技术特点

2.亚克隆文库的构建和cry1Ac基因的筛选

3.cry基因在大肠杆菌中的克隆表达策略

4.cry基因在无晶体突变株XBU001中超表达的机制探讨

5.20-kb DNA的PCR鉴定、来源及作用

结语

参考文献

附录

致谢