软枣猕猴桃性别分化的形态结构观察及差异表达基因研究

摘要

软枣猕猴桃具有提高机体免疫力、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒、防治心脑血管疾病和保肝护肝等功效，以其独特的风味、良好的口感和丰富的营养成为水果界的新宠。性别分化一直是植物学领域研究的热点，软枣猕猴桃是典型的雌雄异株植物，探讨软枣猕猴桃性别分化的生理和分子机制，对于理解其性别分化的机理和生产实践中育种、性别鉴定等方面的应用具有重要的理论和现实意义。本研究通过对软枣猕猴桃雌花和雄花性别分化过程的形态结构进行观察，构建雌花和雄花的差减文库，对差异基因的功能进行注释和表达模式进行分析，克隆重要基因全长并对其序列进行分析，从多方面探讨软枣猕猴桃性别分化的机制。 采用石蜡切片、超景深显微镜和数码成像等方法观察从花芽显现至花序完全开放7个时期雌蕊和雄蕊的形态建成和发育过程。观察结果表明，在雌、雄蕊原基分化之前，无论从外观形态还是显微结构都难以区分雌、雄花。在形态建成初期，雌花和雄花的雌、雄蕊原基都正常进行分化，雌花的雌蕊原基分化过程中呈圆柱形或方体，而雄花的雌蕊原基分化过程中呈锥形或者梯形。雌花的雌蕊原始体可分辨出 8-10 个花柱，而雄花的雌蕊原始体仅呈现2-3个花柱。雌蕊和雄蕊形态建成后，雌花的雌蕊发育速度快，雄蕊发育速度慢，最后败育，同样，雄花的雄蕊发育速度快，雌蕊发育速度慢，最终败育。发育完全的雌花具有完整的雄蕊形态结构，但花粉败育，雌蕊花柱25-30个，心室中形成胚珠，而发育完全的雄花花粉可育，雌蕊柱头8-10个，心室中没有胚珠。 成功构建了雌花和雄花的抑制差减杂交cDNA文库。正、反文库中分别挑选出533个和508个有效克隆，测序、拼接后获得309和369个非冗余Unigene序列，分别有232和301个Unigene在各数据库中得到注释。根据GO分类系统，细胞组分功能二级分类下正、反文库在cell 和cell part功能分类获得注释数量最多;分子功能二级分类下，正、反文库都在catalytic activity和binding功能分类下获得注释数量最多;生物过程二级分类下，正、反文库在metabolic process、cellular process和single-organism process功能分类下获得注释数量最多。此外，正、反文库都在繁育过程（Reproductive process）分类下获得了注释信息。COG数据库中正、反文库找到对应蛋白功能家族的unigene数均为81个，正向文库在10功能家族中没有找到同源蛋白，反向文库仅在4个功能家族中没有找到同源蛋白。正向文库 Unigene 在 KEGG 代谢通路的 Ribosome 和 Protein processing in endoplasmic reticulum通路下分布最多，反向文库在Pentose and glucuronate interconversions通路分布最多。采用半定量和荧光定量PCR分析4个候选基因表达模式，果胶甲酯酶基因在雄花发育后期表达量高，ACC氧化酶、内切-β-甘露聚糖酶和MYC2转录因子在雄花发育后期表达量极低，内切-β-甘露聚糖酶和MYC2转录因子在雌花发育后期表达量上调。 应用RACE技术成功克隆了软枣猕猴桃MYC2转录因子（AaYMC2）和果胶甲酯酶（AaPME）3’和5’端cDNA序列，cDNA全长分别为1559 bp和930 bp，将2个基因的核苷酸和预测编码蛋白序列与NCBI数据库比对，在多个物种上找到同源序列。对AaMYC2和AaPME编码蛋白基本理化性质、空间结构、疏水性和跨膜区域等信息进行分析，初步鉴定这2个基因分别编码MYC2转录因子和果胶甲酯酶蛋白。 本研究结合形态学观察和分子生物学技术手段确定了软枣猕猴桃性别分化的关键时期，筛选到一批雌、雄分化过程中差异表达的基因，鉴定出4个参与性别分化的关键基因，应用RACE技术成功克隆了软枣猕猴桃MYC2转录因子和果胶甲酯酶的cDNA序列。研究结果为进一步探讨软枣猕猴桃性别分化机理奠定基础，也为生产中性别鉴定和性别调控提供理论指导。

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