抗猪囊尾蚴特异性单链抗体基因的克隆与序列分析

摘要

猪囊尾蚴病是猪肉绦虫的幼虫(猪囊尾蚴)寄生于猪的肌肉和其他器官中所引起的一种寄生虫病，又称猪囊虫病。是一种散发性、传染性寄生虫病。本病呈世界性分布，在我国各地均有散发流行，尤其是东北、华北和西南广大地区常有发生，不仅影响养猪业发展，而且严重危害人体健康，是一种重要的人、畜共患病[1]。目前治疗本病除了化学药物以外还没有生物制剂应用。近年来随着分子生物学、生物化学、免疫学的发展，实验方法的不断完善，很多研究者正在试图研制生物制剂。而单链抗体(ScFv)和免疫毒素的应用，对治疗猪囊虫病提供了更快捷、更彻底的方向。单链抗体(ScFv)由抗体重(Vh)、轻(Vl)链可变区通过与一段约5～25个氨基酸连接肽，一般为(Gly4Ser)3，拼接而成的重组蛋白。与完整抗体相比，单链抗体具有更大的优越性[2]，它在非靶向组织中滞留时间短、血清清除速度快、组织穿透力强、其特异性可以在体外用免疫学方法筛选等优点。更重要的是ScFv能在细菌中表达，便于基因操作和基因工程大量生产，还可用基因工程的方法构建与其它效应分子连接的融合蛋白，因此ScFv可成为药物、毒素、放射性物质等导向靶细胞的理想载体。重叠延伸PCR(SOE PCR)技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。本实验先对猪囊尾蚴头节特异性单链抗体轻链可变区基因(Vl)和重链可变区基因(Vh)进行酶切鉴定和PCR鉴定，电泳结果显示，在330bp和370bp左右出现目的条带，与预期结果相符。序列分析结果显示出较高同源性，其中重链的同源性高达94％，轻链的同源性高达为96％。然后采用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术，经过多次实验摸索反应条件，变性温度定义在94℃，40s，在第一轮PCR时，Tm值定义为58℃为最佳；在第二轮PCR时，Tm值定义为52℃为最佳。并且每一轮的循环数定义在25次。将猪囊尾蚴头节特异性单链抗体轻链可变区基因(Vl)和重链可变区基因(Vh)，通过linker连接成目的基因Vl-linker-Vh单链抗体基因，酶切鉴定和PCR鉴定结果显示，在750bp左右出现目的条带，与预期结果相符，并将连接产物连接到pMD-18T载体，转化感受态细胞JM109。本实验为以后进行单链抗体ScFv-PE40重组免疫毒素的构建、在大肠杆菌中的表达及活性的测定奠定良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1猪囊尾蚴病危害及防治研究进展

1.2单链抗体研究进展

1.3重叠延伸PCR技术

1.4本实验的目的及意义

第二章实验内容

2.1材料

2.2方法

第三章结果分析与讨论

3.1 Vl和 Vh基因酶切鉴定结果

3.2 Vl和 Vh基因的PCR鉴定结果

3.3 Vl和 Vh基因的序列测定结果

3.4 Vl-linker-Vh基因PCR结果

3.5连接产物酶切鉴定结果

3.6连接产物PCR鉴定结果

3.7讨论

第四章结论

参考文献

致谢

作者简介