大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究

摘要

本项研究应用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因核心保守序列，构建高效的具有hpRNA和ihpRNA结构的大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体。通过花粉管通道法将其导入大豆，抑制大豆脂肪氧化酶基因的表达，调控脂肪氧化酶的生物合成过程。以期通过基因工程手段，改变大豆脂肪氧化酶合成途径，降低大豆脂肪氧化酶含量，提高大豆油份含量，培育具有优良品质的大豆品种。取得如下结果： 1.改造植物表达载体pCAMBIA1301，去除其臂内潮酶素基因，并在臂内按逆时针方向添加一个从质粒pBI121上酶切下来的35S启动子。 2.以大豆品种“吉农18号”的基因组DNA为模板，选取大豆三种脂肪氧化酶同功酶基因同源性最高部分，通过PCR扩增得到大豆脂肪氧化酶基因片段，将其克隆到pMD18-Tvector载体上，测序结果表明：克隆片段大小为357bp。对比NCBI基因Bank，与已发表的基因一致。将大豆脂肪氧化酶基因片段按正向+反向的顺序插入到pCAMBIA130135S启动子下，构建大豆脂肪氧化酶基因hpRNA干扰表达载体pC1301LoxRi。通过花粉管通道法转化大豆品种“吉农18号”，获得T0代转化籽粒，萌发后以单棵植株叶片的总DNA为模板，以pCAMBIA1301臂内GUS基因设计一对引物进行PCR扩增，结果从6棵植株中扩增得到720bp的特异带，回收该条带连接于pMD18-Tvector载体并测序，结果显示其为要扩增的GUS基因片段。为进一步确定外源基因的整合情况，从PCR阳性植株中随机抽取2株进行Southern blot分析。结果表明，转化株均有杂交带出现，外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入，而未经转化的植株没有杂交信号出现，证明外源基因已整合到大豆基因组中。以转基因大豆籽粒的总RNA反转录成的cDNA为模板做RT-PCR，从电泳条带的亮度上看，转基因植株和非转基因植株的内标18SRNA含量相同，而内源脂肪氧化酶mRNA的含量明显降低。 3.克隆了大豆“吉农18号”自身的一段内含子，片段长度230bp，将其插入到表达载体pC1301LoxRi的正义基因片段和反义基因片段中间，构建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干扰表达载体pC1301LoxiRi。通过花粉管通道法转化大豆品种“吉农18号”，获得T0代转化籽粒，萌发后以单棵植株叶片的总DNA为模板，以pCAMBIA1301臂内T-DNA区GUS基因设计一对引物进行PCR扩增，结果从18棵植株中扩增得到720bp的特异带，回收该条带连接于pMD18-Tvector载体并测序，结果显示其为要扩增的GUS基因片段。为进一步确定外源基因的整合情况，从PCR阳性植株中随机抽取3株进行Southern blot分析。结果表明，转化株均有杂交带出现，外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入，而未经转化的植株没有杂交信号出现，证明外源基因已整合到大豆基因组中。以转基因大豆籽粒的总RNA反转录成的cDNA为模板做RT-PCR，从电泳条带的亮度上看，转基因植株和非转基因植株的内标18SRNA含量相同，而内源脂肪氧化酶mRNA的含量明显降低。 4.以T1代转化的籽粒为材料，采用紫外分光光度法对脂肪氧化酶活性进行了测定，结果显示，转pC1301LoxRi质粒大豆的脂肪氧化酶活性分别为降低62％，转化pC1301LoxiRi质粒大豆的脂肪氧化酶活性减低74％。说明外源基因的导入有效地抑制了脂肪氧化酶基因的表达。 5.以T1代转化的籽粒为材料，采用SDS-PAGE电泳，结果显示转化pC1301LoxRi质粒大豆的脂肪氧化酶含量比对照平均降低55％，转化pC1301LoxiRi质粒大豆的脂肪氧化酶含量比对照平均降低71％。 6.以T1代转化的籽粒为材料，转基因植株蛋白质的凯氏定氮和索氏提取测定结果显示，转基因植株蛋白质含量均有所下降，脂肪含量均有所上升：其中转化pC1301LoxRi质粒植株蛋白质含量平均为36.06％，比非转基因对照降低0.95个百分点(非转基因蛋白质含量37.01％)，最大降低1.28百分点达到35.73％，脂肪平均含量23.89％，比非转基因对照平均提高了0.74个百分点(非转基因脂肪含量23.15％)，最大提高1.09个百分点，达到24.24％；转pC1301LoxiRi质粒植株蛋白质含量平均为35.63％，比非转基因植株对照降低了1.38个百分点(非转基因蛋白质含量37.01％)，最大降低1.62百分点达到35.39％，脂肪平均含量24.33％，比非转基因对照平均提高了1.18个百分点(非转基因脂肪含量23.15％)，最大提高1.61个百分点，达到24.76％。 7.观察T1代转化植株的主要农艺形状，包括：株高、节数、结荚数、单株粒数、虫食粒、百粒重，发现转基因植株与非转基因对照无明显差别。 8.对转基因植株T2代的PCR分析及PCR-Southern结果证明：外源基因在转基因后代中能遗传。其分离比基本符合孟德尔的遗传规律。 9.探讨了应用重组PCR构建植物基因RNA干扰构件，初步证明其是一种简便、快捷、可行、适用范围广的方法。 10.初步探讨了大豆花粉管通道法的室内转化条件，证明在我国北方地区采用花粉管通道法转化大豆可以在室内进行，每年可以加代一次。 本项研究首次将RNA干扰技术应用于改良大豆脂肪氧化酶含量，取得了良好效果，获得了脂肪氧化酶含量明显降低，脂肪含量明显提高的转基因大豆植株，突破了传统育种方法在改良大豆品质方面易受种质资源限制和育种时间长的缺点，为应用RNA干扰技术改良大豆品质提高大豆油份含量探索了新的途径，实现了大豆品质改良育种和高油育种的方法创新，也为以后通过RNA干扰技术改良大豆其它营养抑制因子，提高大豆品质奠定了基础，具有重要的理论和实践意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一篇 文献综述

1.脂肪氧化酶的生理生化与分子生物学研究进展

1.1脂肪氧化酶的基础生理生化研究与分子生物学研究

1.2大豆脂肪氧化酶分析鉴定技术

2.植物RNA干扰作用的研究进展

2.1 RNA干扰的研究简史

2.2植物中由dsRNA介导的基因沉默作用机制及特点

2.3植物中RNA干扰的特点

2.4植物中RNA干扰的诱导方法及比较

2.5植物RNA干扰载体

2.6 RNA干扰在植物中的应用

2.7 展望

3重组PCR技术与植物RNA干扰载体的构建

3.1重组PCR原理

3.2应用重组PCR技术构建植物RNA干扰载体

4.大豆的遗传转化技术

4.1农杆菌介导法

4.2基因枪法(Particlegun)

4.3花粉管通道法

4.4电激法

4.5超声波辅助农杆菌转化法

4.6显微注射法

4.7聚乙二醇法

5.本项目研究的目的和意义

6.创新点

第二篇研究内容

第一章 大豆脂肪氧化酶基因片段的克隆与RNA干扰表达载体的构建

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论与结论

第二章 重组PCR技术与植物RNA干扰元件的克隆

1实验原理

2.材料与方法

3.结果与分析

4.讨论

5.结论

第三章 大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰载体的遗传转化及结果分析

1.材料与方法

2.转基因植株的检测

3.结果与分析

4.讨论

5.结论

参考文献

附录

致谢