猪囊尾蚴单链抗体PE40重组载体构建

摘要

猪囊尾蚴病是全球性寄生性蠕虫病，发展中国家更为常见，尤其在我国，该病的流行给人民生产和生活带来诸多危害，给人类的健康带来严重的影响。我国至少已有31个省(市、自治区)有过该病的报道，囊尾蚴病患者约1000万，每年屠宰的囊尾蚴病猪约1200万头，直接经济损失约20亿元。脑囊尾蚴病对人类的健康危害极大，在某些发展中国家，脑囊尾蚴病是引起人死亡的主要原因之一。 由于抗药性的不断出现以及药物残留等问题的严重性，使得利用免疫预防技术来取代药物成为控制猪囊尾蚴病的必然。免疫毒素是一种导向药物，它将毒素基因和靶向基因融合，表达融合蛋白，具有识别和选择性地破坏受体靶细胞的功能，它由导向部分和毒性部分组成。 绿脓杆菌外毒素通常作为重组毒素的毒性成分，其毒性本质是它能够催化真核细胞延伸因子的ADP核糖基化，阻止肽链延长并中断细胞蛋白质的合成而行使细胞毒作用。作为重组毒素的导向部分，除能够与特定靶细胞表面受体结合外，同时能够与毒素基因相融合，表达出融合蛋白，且二者不影响各自独立结构和功能。将猪囊尾蚴头节单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE40基因连接，装入表达载体pET-28(a)中，以获得重组毒素，研究其对猪囊尾蚴的杀灭作用。 从绿脓杆菌ATCC27853菌株中提取基因组，根据GenBank发表的绿脓杆菌外毒素基因全序列，自行设计引物，分别引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位点。 采用PCR方法扩增PE40基因，在反应体系中加入10％总体积的甘油，电泳检测，纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接构建质粒pMD18-T-PE40，转入大肠杆菌感受态JM109中，蓝白斑筛选阳性克隆菌，提取质粒进行酶切鉴定及PCR鉴定，并测序。 质粒pMD18-T-PE40经：XbaⅠ和HindⅢ双酶切后电泳显示2692bp和1083bp两条带，测序结果显示扩增的PE40基因共有10个碱基发生改变，变异的碱基引起7个氨基酸发生变化，但PE40肽段的重要活性位点与绿脓杆菌标准产毒株PA103相比均未发生变化。 含有ScFv基因的质粒pMD18-T-ScFv已经构建，且ScFv基因两端的酶切位点分别为EcoRⅠ和XbaⅠ，用XbaⅠ和HindⅢ分别对质粒pMD18-T-PE40和pMD18-T-ScFv进行双酶切，利用XbaⅠ和HindⅢ酶切位点将PE40基因与质粒pMD18-T-ScFv相连接，转入大肠杆菌感受态JM109中，挑取阳性菌酶切鉴定。 经酶切电泳分析，得到大小约为1800bp的目的片段，与预期结果相同，说明ScFv与PE40已连接成功。用EcoRⅠ和HindⅢ分别对重组质粒pMD18-T-ScFv-PE40和表达载体pET-28(a)进行酶切，将ScFv-PE40转入pET-28(a)表达载体中构建融合毒素pET28-ScFv-PE40，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，挑取阳性菌落提取质粒，酶切电泳检测，得到目的条带大小约为1800bp，保存菌种，为进一步研究重组免疫毒素对猪囊尾蚴的杀灭作用奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章前言

1.1猪囊尾蚴病的危害

1.2猪囊尾蚴病病原入侵与免疫机制

1.3猪囊尾蚴的免疫逃避机制

1.4猪囊尾蚴病疫苗防治的研究进展

1.5绿脓杆菌

1.6绿脓杆菌外毒素A(PE)的基本特征及研究现状

1.7其他免疫毒素

1.8本研究的目的和意义

第二章实验内容 猪囊尾蚴单链抗体PE40重组载体构建

2.1材料

2.2方法

2.3 结果

2.4讨论

第三章结论

参考文献

致谢

个人简介