人类锌指蛋白家族新基因ZNF540的克隆与功能研究

摘要

在心血管发病机理中，转录因子对基因表达调控起重要的作用。确定对心血管系统中起作用的调控基因对于了解先天性心脏病和其它心血管疾病的发病机理非常必要。Cys2/His2型锌指蛋白基因是一类很大的转录调控因子家族基因，已发现很多Cys2/His2型锌指蛋白参与了心脏发育和心血管疾病。
　　 ZNF540就是本文作者在利用生物信息学方法筛选人类心脏发育候选基因的过程中发现的一个人类新基因。ZNF540 cDNA全长3335个碱基，ORF全长1983个碱基，编码一个长661个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白包含一个KRAB结构域和17个锌指结构域。Northern结果显示ZNF540在6个月胚胎中有广泛表达。ZNF540的COS-7亚细胞定位于细胞核，转录活性分析表明，ZNF540-BD通过KRAB框抑制VP-16基因的转录活性， COS-7细胞中过表达ZNF540蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子ELK-1和SRE的转录抑制活性。综合目前的研究结果来看，ZNF540可能通过MAPK信号途径参与对细胞生命活动的调控过程。
　　 利用酵母双杂交实验筛选ZNF540的相互作用蛋白，得到96个蓝斑，测序发现其中一个为MVP。免疫共沉淀实验和细胞信号报告基因活性分析都初步证明了ZNF540和MVP可能存在相互作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：中英文缩写词简表

声明

一心脏发育与基因转录及信号传递

1.1心脏发育概论

1.2心脏发育的基因调控

1.3锌指蛋白与心脏发育

1.3.1锌指蛋白的分子作用机理

1.3.2锌指蛋白的分类、结构和作用机理

1.3.3和心脏发育关系密切的几种锌指蛋白

1.4 MAPK信号途径与心脏发育

1.4.1 MAPK信号转导途径

1.4.2 MAPK途径基本特点

1.4.3 MAPK的四种主要途径

1.4.4 MAPK途径特异性的实现

1.4.5 MAPK信号途径和与基因调控

二材料与方法

2.1仪器设备与材料

2.1.1主要材料

2.1.2主要仪器与设备

2.2主要方法

2.2.1生物信息学软件与方法

2.2.2 PCR相关技术

2.2.3质粒的构建

2.2.4组织总RNA的抽提

2.2.5人类胚胎心脏PCR cDNA文库的构建

2.2.6 Northern杂交实验

2.2.7常规细胞培养及转染

2.2.8 亚细胞定位观察

2.2.9基因信号途径的report assay

2.2.10转基因稳定表达细胞系的建立

2.2.11酵母双杂交相关实验与方法

2.2.12 ZNF540与MVP免疫共沉淀

三结果与讨论

3.1 ZNF540的分子克隆

3.2 ZNF540基因序列结构、功能及其家族蛋白同源性等的生物信息学分析

3.2.1 ZNF540基因的基因组结构分析

3.2.2 ZNF540基因的结构特点

3.2.3 ZNF540蛋白质结构和功能的生物信息学分析

3.2.4生物信息学表达分析

3.2.5 ZNF540与同源基因的编码蛋白的同源性比较及活化分析

3.2.6 MVP蛋白质结构和功能的生物信息学分析

3.3 ZNF540的表达分析

3.4亚细胞定位分析

3.5 ZNF540基因的报告基因分析

3.7 ZNF540基因对细胞周期的影响

3.8 ZNF540与MVP蛋白的相互作用

3.8.1 ZNF540与MVP的免疫共沉淀

3.8.2 ZNF540蛋白和MVP共同对信号途径产生影响

结束语

参考文献(References)：

发表文献

致谢